一种用于诊断膀胱癌的联合标志物及试剂盒和应用制造技术

本发明专利技术涉及血清样品中小分子代谢物甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸作为联合标志物在制备用于诊断受试者中膀胱癌的试剂盒中的新应用。本发明专利技术还涉及检测受试者中的膀胱癌的试剂盒，通过检测来自受试者的血清样品中上述联合标志物各自的浓度，基于二元逻辑回归方程计算所述联合标志物变量，再基于确定的截点值，判断所述受试者是否患有膀胱癌。所述试剂盒可实现高灵敏、高效检测本发明专利技术涉及的几种小分子代谢物，且具有检测成本低，重复性好的特点。上述几种小分子代谢物联合使用，可在膀胱癌的辅助诊断中得到应用。

A Combined Marker and Kit for the Diagnosis of Bladder Cancer and Its Application

The present invention relates to a new application of small molecule metabolites such as choline glycophosphate, cystine, dodecanoic acid, eicosaponoic acid and goosedeoxycholic acid in the preparation of a kit for the diagnosis of bladder cancer in subjects. The invention also relates to a kit for detecting bladder cancer in a subject. By detecting the respective concentrations of the combined markers in a serum sample from the subject, the variable of the combined markers is calculated based on binary logistic regression equation, and then the cut-off value is determined to determine whether the subject has bladder cancer. The kit can realize high sensitivity and high efficiency detection of several small molecule metabolites of the present invention, and has the characteristics of low detection cost and good repeatability. These small molecule metabolites can be used in assistant diagnosis of bladder cancer.

【技术实现步骤摘要】
一种用于诊断膀胱癌的联合标志物及试剂盒和应用
本专利技术涉及已知代谢物的新用途。具体地，本专利技术涉及血清中的甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸联合用作诊断膀胱癌的标志物，并且涉及检测受试者中的膀胱癌的试剂盒和系统。
技术介绍
膀胱癌(Bladdercancer，BC)是第二常见的影响泌尿系统的人类恶性肿瘤，也是全球范围内最致命的癌症之一，近几十年其发病率和死亡率逐渐上升。膀胱癌的发生发展机制至今尚未阐明，其风险因素涉及多基因遗传、环境因素及生活方式的综合作用。膀胱癌早期发现是提高患者生存率的关键，对于早期患者其存活率高达95％；然而对于晚期患者存活率降低到50％左右。但是膀胱癌早期并无明显症状，导致其诊断十分困难。目前的标准临床诊断方法包括膀胱镜和尿细胞学检查：膀胱镜作为一种侵入性的方法，是在膀胱的直接观察，但不能显现某些部位和癌某些情况下的原位；尿细胞学检查包括显微镜观测尿涂片检查异常细胞，血液和其他标记。虽具有无创性和高度特异性，但它缺乏检测低级别肿瘤的敏感性。(文献1：GAOZhen-Yu,XIANGMin,AntiInfectPharm2016,13(4):725-728)。因此，为了提高膀胱癌早期临床诊断的灵敏度和特异性，开发新的诊断方法势在必行。已有研究表明，膀胱癌的发生发展与多种小分子代谢物紊乱密切相关，例如氨基酸代谢，脂质代谢，胆汁酸代谢等。本专利技术通过液相色谱质谱联用的代谢组学方法检测血中的代谢物，经过生物信息学分析，筛选目标代谢物，有望在膀胱癌的诊断中有应用。而且，色谱质谱联用技术为小分子代谢物的检测提供了快速、灵敏的重复性好、成本低的检测方法。色谱质谱联用技术检测小分子代谢物在疾病诊断中的应用已有成功的案例。如液质谱联用技术检测肌氨酸判别前列腺癌(文献2：Sreekumar,A.；Poisson,L.M.；Rajendiran,T.M.；Khan,A.P.；Cao,Q.；Yu,J.；Laxman,B.；Mehra,R.；Lonigro,R.J.；Li,Y.；Nyati,M.K.；Ahsan,A.；Kalyana-Sundaram,S.；Han,B.；Cao,X.；Byun,J.；Omenn,G.S.；Ghosh,D.；Pennathur,S.；Alexander,D.C.；Berger,A.；Shuster,J.R.；Wei,J.T.；Varambally,S.；Beecher,C.；Chinnaiyan,A.M.,Nature2009,457,(7231),910-914)；以及液质谱联用技术检测血清中甘磷酸胆碱等13个差异代谢物作为联合标志物进行膀胱癌辅助诊断(文献3：CHENYong-Jing,WANGXiao-Hua,HUANGZhen-Zhen,LINLin,GAOYao,ZHUEr-Yi,XINGJin-Chun,ZHENGJia-Xin,HANGWei.ChineseJ.Anal.Chem.,2012,40(9):1322-1328)等。本专利技术确定的甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸都是人体重要的代谢物，参与人体多种病理生理过程。甘磷酸胆碱是合成乙酰胆碱的原料，是一种支持人类激素生产的神经递质。胆碱目前被认为是一个重要的维生素，涉及到脂质代谢和葡萄糖体内平衡调节(文献4：F.P.Martinetal.,J.ProteomeRes.9,5284(2010))。胱氨酸具有促进细胞氧化还原的功能，与细胞能量代谢密切相关。十二碳烯酸和二十碳烯酸均为游离不饱和脂肪酸。游离脂肪酸是人体内的储能物质，其浓度异常与临床上很多疾病的发生发展密切相关。(文献5：RodenM,PriceTB,PerseghinG,PetersenKF,RothmanDL,ClineGW,ShulmanGI.J.Clin.Invest.,1996,97(12):2859-2865)。鹅去氧胆酸是一种具有杀菌、抗炎作用的胆汁酸。它不仅参与机体脂质的乳化吸收和运输，还通过多种细胞膜、胞内蛋白共同作用所介导的信号事件在机体的糖代谢、脂代谢以及能量代谢中起着重要的调节作用(文献6：PellicoroA,FaberKN.AlimentPharmacolTher,2007,26(2):149-160)。但到目前为止甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸尚无研究将其作为联合标志物应用于膀胱癌。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对膀胱癌诊断复杂、灵敏度低的临床问题，提供一种组合的小分子代谢物在膀胱癌辅助诊断中的应用，并提供可用于上述组合的小分子代谢物的分析检测方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：(1)利用高效液相色谱质谱联用的代谢组学技术，对正常人和膀胱癌患者血清进行了非靶向代谢组学分析，发现并定性35种代谢物在正常人和膀胱癌患者中存在显著性差异；(2)使用数据统计软件SPSS，通过二元逻辑回归分析方法(文献7：1.BewickV,CheekL,BallJ,Criticalcare2005,9(1):112-118)，结合代谢物生理功能在35个差异代谢物中随机组合，回归为联合标志物变量，然后用受试者工作特征曲线ROC(receiveroperatingcharacteristic)的曲线下面积AUC(AreaUnderCurve)来评价联合标志物的灵敏度和特异性。ROC曲线是根据一系列不同的二分类方式，以灵敏度为纵坐标，特异度为横坐标绘制的曲线，其中灵敏度是将实际有病的人正确地判定为真阳性的比例，特异度是将实际无病的人正确地判定为真阴性的比例。灵敏度和特异性均较高，同时兼顾简便性(即参与组合的代谢物个数比较少)的组合可以作为联合标志物；(3)应用另外一批正常人和膀胱癌患者血清样本对组合代谢标志物进行验证，确定甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸可作为辅助诊断膀胱癌的联合标志物；(4)联合标志物的使用：在膀胱癌病人中甘磷酸胆碱、胱氨酸、二十烯酸的含量显著性上调，而十二碳烯酸和鹅去氧胆酸的含量显著性下调。使用数据统计软件SPSS，通过二元逻辑回归分析方法，将甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸回归为联合标志物变量P，优选地，二元逻辑回归方程如下：方程1：P＝1/1+e-(0.103×a+1.534×b-2.353×c+2.554×d-1.489×f+0.431)其中，a为血清样品中甘磷酸胆碱浓度，b为血清样品中胱氨酸浓度，c为血清样品中十二碳烯酸浓度，d为血清样品中二十碳烯酸浓度，f为血清样品中鹅去氧胆酸浓度。所得变量P在膀胱癌中增高，该变量的值可用于辅助判定膀胱癌。在此，基于试验涉及的样本，根据诊断灵敏度和特异性最佳的原则，即ROC曲线下面积(AUC)最大的原则，该联合标志物变量的截点值(cut-off值)设为0.500，高于该截点值则有可能为膀胱癌。也可以根据实验者的实际结果通过二元逻辑回归得到新的方程，并定义该实验室的最佳截点值。(5)诊断系统所包括的装置：色谱柱为SeQuantZICHILIC色谱柱，检测仪器为超高效液相色谱串联质谱仪，使用正、负离子检测模式；(6)确定试剂盒最佳组成：a.标准品：甘磷酸胆碱、胱氨酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于诊断膀胱癌的联合标志物，包括甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸。

【技术特征摘要】
1.一种用于诊断膀胱癌的联合标志物，包括甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸。2.联合标志物在制备用于诊断受试者中的膀胱癌的试剂盒中的应用，其中所述联合标志物包括甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸。3.一种检测受试者中的膀胱癌的试剂盒，所述试剂盒包括：(1)标准品：包括甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸，所述标准品分别用于绘制对应的血清代谢物甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸的定性和定量标准曲线；(2)用于预处理来自受试者的血清样品的提取液：包含内标1-13C-缬氨酸、D4-鹅脱氧胆酸、D3-棕榈酸的甲醇溶液；(3)用于洗脱色谱柱的洗脱液。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中所述用于洗脱色谱柱的洗脱液是用于洗脱SeQuantZIC-HILIC色谱柱的洗脱液。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其中所述洗脱液包括：流动相A：包含10mM乙酸铵和0.02％(v/v)乙酸的95％(v/v)乙腈水溶液；流动相B：包含10mM乙酸铵和0.02％(v/v)乙酸的水溶液。6.一种通过权利要求3-5任一所述试剂盒计算受试者的血清样品中代谢物甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸含量的方法；所述方法包括下述步...

【专利技术属性】
技术研发人员：许国旺，郑思佳，赵欣捷，王晴晴，王晓琳，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21