一种血浆中militarine及其代谢物的定性定量分析方法技术

本发明专利技术公开了一种血浆中militarine及其代谢物的定性定量分析方法，采用超高效液相色谱‑四级杆飞行时间串联质谱仪(UPLC‑Q‑TOF‑MS)对militarine入血后中的原型成分及其代谢物进行分析鉴定，在此基础上采用高效液相色谱‑电喷雾‑串联质谱仪(HPLC‑ESI‑MS/MS)对口服militarine后血浆中的原型成分及其代谢物gymnoside I、gastrodin、α‑isobutylmalic进行含量测定。本发明专利技术测定方法选择性强、灵敏度高、检测快速、重现性好，可用于含militarine制剂的高通量体内药物分析、药代动力学研究与质量控制。

A Qualitative and Quantitative Analysis Method for Militarine and Its Metabolites in Plasma

The present invention discloses a qualitative and quantitative analysis method for militarine and its metabolites in plasma. The prototype components and metabolites of militarine after blood transfusion are analyzed and identified by ultra high performance liquid chromatography (HPLC) four stage rod time of flight mass spectrometry (UPLC Q TOF MS). On the basis of this, the high performance liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry (HPLC ESI ESI MS/MS) is used for oral administration. The prototype components and their metabolites gymnoside I, gastrodin and alpha isobutylmalic in plasma were determined after militarine. The method has strong selectivity, high sensitivity, fast detection and good reproducibility, and can be used for high throughput in vivo drug analysis, pharmacokinetic research and quality control of militarine preparations.

【技术实现步骤摘要】
一种血浆中militarine及其代谢物的定性定量分析方法
本专利技术涉及药物分析领域，特别涉及一种血浆中militarine及其代谢物的定性定量分析方法。
技术介绍
militarine是从兰科植物白及Bletillastriata(Thunb.)Reiehb.f.的干燥块茎中分离提取的一种葡萄糖氧苄基双取代异丁基苹果酸酯类化合物。其结构式如下：现代研究表明，militarine为白及中含量较高的活性成分，其在白及药材中的含量高达1.45％～3.32％。且药理研究证实，militarine能够改善慢性脑缺血大鼠的认知功能障碍，具有减轻脑白质缺血性损伤及舒张血管作用。因此，militarine具有良好的创新药物开发前景。据统计，在创新药物的研发过程中，约35％的候选化合物在临床前研究阶段因体内药代动力学行为不良而停止开发。而进入临床研究后，又有约40％的候选药物因药代动力学参数不佳而遭淘汰。为此，对药物体内过程的研究己成为新药开发的一个重要组成部分，要在新药开发的早期阶段对候选化合物的药动学性质进行综合的评价，为设计和优化临床研究给药方案提供理论依据，确保临床用药的安全性和合理性。生物样品中药物浓度的检测是药代动力学研究和临床研究的基础。由于进行药代动力学研究的生物样品存在浓度较低，基质环境复杂等难题，只有建立可靠、专一、灵敏、快速的生物样品分析方法，才能够实现高通量生物样品分析过程，满足药代动力学研究大样本量的要求。目前关于militarine的血药浓度检测方法未见文献报道，因此开展militarine入血后的原型成分及其代谢物的分析鉴定，建立militarine及其代谢物在血浆中的含量测定方法，可为其创新药物的临床前药代动力学研究奠定基础。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的是提供一种有效的血浆中militarine及其代谢物的定性定量分析方法。为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种血浆中militarine及其代谢物的定性定量分析方法，包括以下步骤：采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱仪(UPLC-Q-TOF-MS)对militarine入血后的原型成分及其代谢物进行分析鉴定，在此基础上采用高效液相色谱-电喷雾-串联质谱仪(HPLC-ESI-MS/MS)对口服militarine后血浆中的原型成分及其代谢物gymnosideI、gastrodin、α-isobutylmalic进行含量测定。优选的，血浆中militarine及其代谢物分析鉴定的大鼠口服给药及血浆样品处理方法包括以下步骤：选择生长状态相似的健康SD大鼠8只。动物随机分为空白组和药物组，每组4只。给药前禁食不禁水12h。药物组经尾静脉注射militarine30mg/kg，空白组大鼠静脉注射等量生理盐水。于给药后0.5、1、1.5、2、3、4h经尾静脉取血约0.5mL，置涂有肝素的塑料离心管中。6000r/min离心6min后分离血浆，等量混合各时间点血浆。取混合后的血浆2mL，用5倍量甲醇沉淀蛋白，离心后得到上清液，37℃N2吹干。残留物用200μL50％甲醇水溶液溶解，涡混1min，超声10min，4℃、12000r/min离心10min，取上清液供UPLC-Q-TOFMS检测分析。优选的，血浆中militarine及其代谢物分析鉴定的UPLC-Q-TOFMS色谱条件包括以下步骤：色谱柱：WatersBEHC18(2.1mm×50mm,1.7μm)柱；流动相：0.01％甲酸水溶液(A)-0.01％甲酸乙腈(B)，梯度洗脱：0～2min，5％B，Curve：initial；2～5min，5％～15％B，Curve：6；5～8min，15％～15％B，Curve：1；8～10min，15％～45％B，Curve：6；10～14min，45％～95％B，Curve：6；14～15min，95％～5％B，Curve：1；流速：0.5mL/min；柱温：35℃；进样体积：1μL。优选的，血浆中militarine及其代谢物分析鉴定的UPLC-Q-TOFMS质谱条件包括以下步骤：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描(ESI-，m/z50～1200)；毛细管电压：1.5kV；离子源温度：100℃；锥孔电压：30V；脱溶剂气温度：300℃；锥孔气流量：50L/h；碰撞能量：20-30V；脱溶剂气流量：10L/min；数据采集模式：MSEContinuum；甲酸钠校正；校正模式：sensitivity；质谱数据采集及处理软件为：MasslynxV4.1工作站。扫描方式：MSCentroid模式。优选的，血浆中militarine及其代谢物HPLC-ESI-MS/MS含量测定的大鼠口服给药方法包括以下步骤：取SD大鼠6只(230±20)g，雌雄各半，禁食12h，自由饮水。militarine口服给药剂量为60mg/kg，于给药前及给药后0.033，0.083，0.167，0.33，0.5，1，1.5，2，4，6，8，12，24，36h进行颈静脉插管取血约0.3mL，置涂有肝素的塑料离心管中。6000r/min离心6min后分离血浆，-20℃冰箱中保存，直至分析。优选的，血浆中militarine及其代谢物HPLC-ESI-MS/MS含量测定的血浆样品处理方法包括以下步骤：取大鼠血浆100μL，置1.5mL塑料离心管中，补加50μL甲醇，加20ng·mL-1内标溶液20μL，加入40μL1％甲酸，加入400μL甲醇，涡混1min，超声10min，4℃、12000rpm离心10min，取上清液置离心管中，37℃N2吹干，残留物用200μL50％甲醇水溶液溶解，涡混1min，超声10min，4℃、12000r/min离心10min，取上清液供HPLC-ESI-MS/MS检测分析。优选的，血浆中militarine及其代谢物HPLC-ESI-MS/MS含量测定的色谱条件包括以下步骤：色谱柱：ACEUltraCoreSuperC18(2.1mm×100mm，2.5μm)柱，流速：0.20mL·min-1，柱温：45℃，进样器的温度：25℃，进样体积为1μL，流动相：0.1％甲酸乙腈-0.1％甲酸水，进行梯度洗脱。优选的，血浆中militarine及其代谢物HPLC-ESI-MS/MS含量测定的质谱条件包括以下步骤：电喷雾电离源(ESI)，正、负模式同时扫描，毛细管电离电压：3kV，离子源温度：120℃；喷雾气与反吹气：N2，去溶剂气流速：650L·hr-1，去溶剂气温度：350℃，扫描方式为选择离子监测(MRM)，质谱数据采集及处理软件为Analyst、MultiQuant工作站。本专利技术中，若无特殊说明，百分比％均指的质量百分比。本专利技术具有以下有益效果：首次建立了血浆中militarine及其代谢物gymnosideI、Gastrodin、α-isobutylmalic的定性定量分析方法，从大鼠血浆中鉴定了militarine的3种代谢产物(gastrodin、α-isobutylmalic和gymnosideI)。同时建立了一种灵敏、快速、简便的HPLC-MS/MS法测定大鼠血浆中militarine及其3种代谢物(gastrodi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种血浆中militarine及其代谢物的定性定量分析方法，其特征在于：包括采用超高效液相色谱‑四级杆飞行时间串联质谱仪对militarine入血后的原型成分及其代谢物进行分析鉴定，确定血浆中原型成分为militarine，代谢产物为gymnoside I、gastrodin、α‑isobutylmalic；采用高效液相色谱‑电喷雾‑串联质谱仪，以葛根素为内标物，对口服militarine后血浆中的原型成分及其代谢物gymnoside I、gastrodin、α‑isobutylmalic进行含量测定。

【技术特征摘要】
1.一种血浆中militarine及其代谢物的定性定量分析方法，其特征在于：包括采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱仪对militarine入血后的原型成分及其代谢物进行分析鉴定，确定血浆中原型成分为militarine，代谢产物为gymnosideI、gastrodin、α-isobutylmalic；采用高效液相色谱-电喷雾-串联质谱仪，以葛根素为内标物，对口服militarine后血浆中的原型成分及其代谢物gymnosideI、gastrodin、α-isobutylmalic进行含量测定。2.根据权利要求1所述的血浆中militarine及其代谢物的定性定量分析方法，其特征在于：血浆中militarine及其代谢物分析鉴定的大鼠口服给药及血浆样品处理方法包括以下步骤：选择生长状态相似的健康SD大鼠；动物随机分为空白组和药物组；给药前禁食不禁水12h；药物组经尾静脉注射militarine30mg/kg，空白组大鼠静脉注射等量生理盐水；于给药后0.5、1、1.5、2、3、4h经尾静脉取血约0.5mL，置涂有肝素的塑料离心管中；6000r/min离心6min后分离血浆，等量混合各时间点血浆；取混合后的血浆2mL，用5倍量甲醇沉淀蛋白，离心后得到上清液，37℃N2吹干；残留物用200μL50％甲醇水溶液溶解，涡混1min，超声10min，4℃、12000r/min离心10min，取上清液供UPLC-Q-TOFMS检测分析。3.根据权利要求1所述的血浆中militarine及其代谢物的定性定量分析方法，其特征在于：血浆中militarine及其代谢物分析鉴定的UPLC-Q-TOFMS色谱条件包括以下步骤：色谱柱：WatersBEHC18(2.1mm×50mm,1.7μm)柱；流动相：0.01％甲酸水溶液(A)-0.01％甲酸乙腈(B)，梯度洗脱：0～2min，5％B，Curve：initial；2～5min，5％～15％B，Curve：6；5～8min，15％～15％B，Curve：1；8～10min，15％～45％B，Curve：6；10～14min，45％～95％B，Curve：6；14～15min，95％～5％B，Curve：1；流速：0.5mL/min；柱温：35℃；进样体积：1μL。4.根据权利要求1所述的血浆中militarine及其代谢物的定性定量分析方法，其特征在于：血浆中militarine及其代谢物分析鉴定的UPLC-Q-TOFMS质谱条件包括以下步骤：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；毛细管电压：1.5kV；离子源温度：100℃；锥孔电压：30V；脱溶剂气温度：300℃；锥孔气流量：50L/h；碰撞能量：20-30V；脱溶剂气...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄勇，郑林，李勇军，巩仔鹏，李月婷，王爱民，孙慧园，杨畅，刘亭，刘春花，马雪，潘洁，
申请(专利权)人：贵州医科大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52