一种鉴别硫酸软骨素来源HPLC检测方法技术

本发明专利技术提供了一种快速鉴别硫酸软骨素原料的来源的HPLC法,鉴别过程不需要样品预处理、直接对样品分析,简单易行,方法稳定,结果准确,极大缩短了鉴别时间；（2）本方法能够较好地实现对鲨鱼、牛、鸡或者猪来源的硫酸软骨素溯源问题。

A Method for Identification of Chondroitin Sulfate Sources by High Performance Liquid Chromatography

【技术实现步骤摘要】
一种鉴别硫酸软骨素来源HPLC检测方法
本专利技术属于质量检测领域，具体涉及一种鉴别硫酸软骨素来源HPLC检测方法。
技术介绍
硫酸骨素(chondroitinsulfate，CS)作为一种具有天然活性的酸性粘多糖类物质，广泛的存在于动物组织，尤其是软骨和结缔组织中。不同动物来源的CS种类和数量各不相同造就了CS生物活性的多样性，随着对CS功能性质的研究和应用的不断深入，CS被广泛的应用于保健食品、药品和临床中。目前，由于原料来源、生产工艺以及使用的测定方法不同，许多文献报道的CS的产率和纯度差别很大，使得CS的质量很难控制，因此，CS的含量测定在检验生产工艺、产品进行质量控制等方面的作用也越来越重要。不同动物软骨中CS硫酸化差异较大。由于分子的不均一性特征,CS的来源、制备方法、纯度和相对分子量等因素均可影响其质量。虽然目前人们已经开发出了CS的检测分析方法,但是现有的方法大部分都存在着弊端,适用性有待提高。CN102103074A公开了一种鉴别硫酸软骨素来源的方法，该方法在25℃的室温下，采用近红外光谱分析仪取得待测来源的硫酸软骨素的原始近红外光谱，然后与数学模型进行对比分析，得出其来源，该方法虽然简单，但准确度不高，干扰因素多，重复性差并且只能是定性分析。现有的分析方法有以下缺点：（1）硫酸软骨素的物种来源一般需要使用生物技术,操作繁琐,资金投入大,而且检测周期长,不利于实际应用；（2）软骨素酶ABC酶解高效液相色谱法测定硫酸软骨素的物种来源往往需要使用反相柱或阴离子交换柱，这些都需要使用二元梯度泵系统，对设备要求较高，耗费试剂，速度较慢，不能满足快速分析的要求。本专利技术用于检测CS的含量及鉴定CS的物种来源,具有准确、快速、方便等优点,克服了传统检测方法的弊端,应用前景良好。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种鉴别硫酸软骨素来源HPLC检测方法。为实现上述目的，本专利技术具体方案为：本专利技术所述一种鉴别硫酸软骨素来源HPLC检测方法，该检测方法步骤为：(1)检测波长的测定取CS标准品溶液适量,以去离子水为参比溶液,用1cm光程长的比色皿扫描测定190-1100nm的紫外可见吸收曲线，得到化合物的紫外可见光谱；(2)色谱条件色谱柱:安捷伦ZorbaxSAX；流动相A为水溶液，流动相B为2mol·L-的氯化钠溶液，梯度洗脱；检测波长为232nm；流速为1.0ml·min-；柱温：40℃；(3)酶解条件根据称样量及酶活性加入过量的CSABC酶解液200μL，CS,ABC酶解液反应温度为30-40℃，反应时间2-5h，在进样前先将样品液在100℃加热使其凝固，经离心除去杂质，再经0.45μm滤膜滤过，可得澄清的供试品溶液；(4)对照品储备液及工作液的制备适量取硫酸软骨素对照品干燥，精密称取200mg于小烧杯中，加入二乙睛，振荡使其分散均匀，再加入纯水，超声波溶解，转移至100mL容量瓶，加水定容，制成质量浓度为2mg/mL的储备液储于冰箱中；精密量取对照品储备液0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0mL，分别置于10mL容量瓶中，加水至刻度并摇匀，在进行高效液相色谱仪测定前用0.45μm滤膜过滤。本专利技术所述一种鉴别硫酸软骨素来源HPLC检测方法，该检测方法步骤（2）色谱条件：色谱柱:安捷伦ZorbaxSAX(250mm×4.6mm,5μm)；流动相A为水溶液(pH3.5)流动相B为2mol•L-的氯化钠溶液(pH3.5)，梯度洗脱；检测波长为232nm；流速为1.0ml•min-；柱温：40℃。本专利技术所述一种鉴别硫酸软骨素来源HPLC检测方法，该检测方法步骤(3)酶解条件ABC酶解液反应温度为37℃，反应时间3h，样品液加热时间为3min。本专利技术所述一种鉴别硫酸软骨素来源HPLC检测方法，其特征在于，该检测方法步骤(4)对照品储备液及工作液的制备：适量取硫酸软骨素对照品于105℃下干燥4h，精密称取200mg于小烧杯中，加入10.0mL二乙睛，振荡使其分散均匀，再加入纯水，超声波溶解，转移至100mL,容量瓶，加水定容，制成质量浓度为2mg/mL的储备液储于4℃冰箱中；精密量取对照品储备液0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0mL，分别置于10mL,容量瓶中，加水至刻度并摇匀，在进行高效液相色谱仪测定前用0.45μm滤膜过滤。本专利技术有益效果：（1）本专利技术提供了一种快速鉴别硫酸软骨素原料的来源的HPLC法,鉴别过程不需要样品预处理、直接对样品分析,简单易行,方法稳定,结果准确,极大缩短了鉴别时间；（2）本方法能够较好地实现对鲨鱼、牛、鸡或者猪来源的硫酸软骨素溯源问题。附图说明：图1：来源于鲨鱼的CS色谱图；图2：来源于鸡的CS色谱图；图3：来源于牛的CS色谱图；图4：来源于猪的CS色谱图。具体实施方式下面实施例只为进一步说明本专利技术方案，不以任形式限制本专利技术范围。(1)检测波长的测定取CS标准品溶液适量,以去离子水为参比溶液,用1cm光程长的比色皿扫描测定190-1100nm的紫外可见吸收曲线，得到化合物的紫外可见光谱。CS的最大吸收在232nm，因此本实验选择232nm为CS的检测波长。(2)色谱条件色谱柱:安捷伦ZorbaxSAX(250mm×4.6mm,5μm)；流动相A为水溶液(pH3.5)流动相B为2mol·L-的氯化钠溶液(pH3.5)，梯度洗脱；检测波长为232nm；流速为1.0ml·min-；柱温：40℃。(3)酶解条件的选择为了提高含量测定数据准确性，增大样品取用量，实际测定时称取样品20mg，置25mL量瓶中，加Tris缓冲液20mL使溶解，目的是使CSABC酶在pH8.O介质中保持一个高活性状态，根据称样量及酶活性加入过量的CSABC酶解液200μL，CS,ABC酶解液反应最适宜温度为37℃，反应3h含量达到最大值，故取反应时间为3h。为了减少样品溶液中的蛋白质对色谱柱造成损害，在进样前先将样品液在100℃加热3min使其凝固，经离心除去杂质，再经0.45μm滤膜滤过，可得澄清的供试品溶液。(4)对照品储备液及工作液的制备适量取硫酸软骨素对照品于105℃下干燥4h，精密称取200mg于小烧杯中，加入10.0mL二乙睛，振荡使其分散均匀，再加入纯水，超声波溶解，转移至100mL,容量瓶，加水定容，制成质量浓度为2mg/mL的储备液储于4℃冰箱中；精密量取对照品储备液0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0mL，分别置于10mL,容量瓶中，加水至刻度并摇匀，在进行高效液相色谱仪测定前用0.45μm滤膜过滤。(5)CS含量的计算：CS含量=式中：WS-称取标准品的量（mg）WT-称取样品的量（mg）AT-样品溶液的峰面积之和（μV・S）WS-标准溶液的峰面积之和（μV・S）(6)CS-A和CS-C含量比值计算：式中：AA-CS-A的峰面积（μV・S）Ac-CS-C的峰面积（μV・S）(5)线性实验线性实验结果如表1所示，相关系数r2为1.0000,所以用该方法测定硫酸软骨素的含量，在浓度为0.008mg/L-0.04mg/L之间呈现良好的线性。表1线性实验结果(6)方法的精密度分别选取来源于鱼、牛、猪、鸡的CS样品以及来源于牛的CS标准品,按照上述方法分析含量,平行测定6本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴别硫酸软骨素来源HPLC检测方法，其特征在于，该检测方法步骤为：(1)检测波长的测定取CS标准品溶液适量,以去离子水为参比溶液,用1cm光程长的比色皿扫描测定190‑1100nm的紫外可见吸收曲线，得到化合物的紫外可见光谱；(2)色谱条件色谱柱:安捷伦Zorbax SAX；流动相A为水溶液，流动相B为2mol·L

【技术特征摘要】
1.一种鉴别硫酸软骨素来源HPLC检测方法，其特征在于，该检测方法步骤为：(1)检测波长的测定取CS标准品溶液适量,以去离子水为参比溶液,用1cm光程长的比色皿扫描测定190-1100nm的紫外可见吸收曲线，得到化合物的紫外可见光谱；(2)色谱条件色谱柱:安捷伦ZorbaxSAX；流动相A为水溶液，流动相B为2mol·L-的氯化钠溶液，梯度洗脱；检测波长为232nm；流速为1.0ml·min-；柱温：40℃；(3)酶解条件根据称样量及酶活性加入过量的CSABC酶解液200μL，CS,ABC酶解液反应温度为30-40℃，反应时间2-5h，在进样前先将样品液在100℃加热使其凝固，经离心除去杂质，再经0.45μm滤膜滤过，可得澄清的供试品溶液；(4)对照品储备液及工作液的制备适量取硫酸软骨素对照品干燥，精密称取200mg于小烧杯中，加入二乙睛，振荡使其分散均匀，再加入纯水，超声波溶解，转移至100mL容量瓶，加水定容，制成质量浓度为2mg/mL的储备液储于冰箱中；精密量取对照品储备液0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0mL，分别置于10mL容量瓶中，加水至刻度并摇匀，在进行高效液相色谱仪测定前用0.45μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：何雄，肖利辉，贺莲，张静，刘爱霞，刘娟，
申请(专利权)人：汉寿康运医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43