聚乙二醇化蛋白类药物的平均修饰度测定方法技术

本发明专利技术公开了一种聚乙二醇化蛋白类药物的平均修饰度测定方法，包括如下步骤：(1)使用与未修饰蛋白类药物标准品、聚乙二醇标准品的浓度呈线性关系的多种类型的检测器，分别建立未修饰蛋白类药物标准品、聚乙二醇标准品的浓度与其各自浓度对应的每种类型检测器响应值的标准曲线；(2)检测聚乙二醇化蛋白类药物的响应值；(3)根据标准曲线计算聚乙二醇化蛋白类药物中聚乙二醇、蛋白的含量；(4)计算聚乙二醇化蛋白类药物的平均修饰度。该方法可直接检测PEG修饰蛋白中的蛋白和PEG的量来确定PEG的修饰度，克服现有技术受外界干扰大的缺陷，具有准确性高、重现性好、通用性强、可标准化的特点。

Determination of average modification degree of polyethyleneglycolated protein drugs

The invention discloses a method for determining the average modification degree of polyethylene glycol protein drugs, which includes the following steps: (1) Using various types of detectors linearly related to the concentration of unmodified protein drugs and polyethylene glycol standards, each type of unmodified protein drugs standards and polyethylene glycol standards is established, respectively, corresponding to their respective concentrations. The standard curve of detector response value; (2) the response value of polyethylene glycol protein drugs; (3) the content of polyethylene glycol and protein in polyethylene glycol protein drugs was calculated according to the standard curve; (4) the average modification degree of polyethylene glycol protein drugs was calculated. This method can directly detect the amount of protein and PEG in PEG modified protein to determine the modification degree of PEG. It overcomes the defect that the existing technology is greatly disturbed by the outside world, and has the characteristics of high accuracy, good reproducibility, strong versatility and standardization.

【技术实现步骤摘要】
聚乙二醇化蛋白类药物的平均修饰度测定方法
本专利技术涉及生物医药检测领域，具体涉及一种聚乙二醇化蛋白类药物的平均修饰度测定方法。
技术介绍
蛋白质类药物主要包括多肽、酶、细胞因子、激素、抗体等一些具有特殊功能的蛋白质，随着生物技术的发展，人们可以通过发酵工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程等途径获得所需的蛋白质。但经过大量的临床研究发现，未经任何修饰的蛋白类药物在体内具有半衰期短、免疫原性强、稳定性差、易被体内酶降解等缺陷，从而降低了临床效果。为此，人们尝试通过多种途径对蛋白类药进行改造以适应于临床应用。聚乙二醇(PEG)是重复化学结构[HO-(CH2-CH2-O)n-H]的多聚物，PEG分子中存在大量乙氧基能够与水形成氢键，具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动力学体积，能够改变药物在水溶液中生物分配行为和溶解性。自1970s起，因其低毒性、良好的生物相容性和两亲性被广泛应用于生物医药、食品和化妆品中，PEG是经美国食品药品监督管理局(FDA)批准的极为少数的可作为体内注射药用的聚合物之一。蛋白类药物经过聚乙二醇修饰后，可延长蛋白类药物在体内的半衰期，减少给药次数；增大蛋白类药物分子量，减少肾小球清除；降低了蛋白酶对蛋白类药物的降解作用；PEG与蛋白类药物间的化学键在体内需要时间水解，由此可减缓蛋白类药物的释放；屏蔽药物的抗原位点，降低免疫原性；增加药物的稳定性和溶解性。1991年，第一种用聚乙二醇修饰的蛋白药物PEG腺苷脱氨酶(Pegademase)获得FDA批准上市，用于治疗儿童免疫缺陷症。目前已有多种PEG修饰蛋白药物应用于临床，同时还有更多正处于临床研究阶段。2000年以后上市的PEG修饰蛋白药物PEG偶联至蛋白上后，需对蛋白上结合了多少PEG进行质量控制。目前，PEG平均修饰度的检测方法主要有：三硝基苯磺酸(TTBS)法、荧光胺法、质谱法、液相色谱法、毛细管法、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、拉曼散射光谱、酶解法等。TNBS法和荧光胺法都属于传统的平均修饰度检测法，1966年，Habeeb首次采用三硝基苯磺酸(TNBS)与蛋白表面的赖氨酸ε-氨基发生反应，反应生成物三硝基苯(TNP)在375nm除有特征吸收。该方法可以通过测得的自由氨基间接计算出蛋白质的PEG修饰度，简单易行，但影响因素多，受外界干扰大、重复性较差、测定值较理论值偏高。Stock等采用荧光法代替TNBS法来测定PEG修饰蛋白的平均修饰度。荧光胺与蛋白质表面赖氨酸ε-氨基发生反应，反应产物可产生荧光，通过测定激发荧光强度，可以计算其平均修饰度。该方法较TNBS法灵敏度高，不受PEG的干扰，但易受还原物质的干扰，且荧光胺与蛋白质的反应快速，变异性较大，测定值较理论值偏低。Foser等采用MALDI-TOP测定了PEG-干扰素的平均修饰度，Bullock等测定了PEG-SOD的平均修饰度，该方法对PEG单修饰蛋白的测定准确、直观，但该方法用于随机多位点修饰蛋白测定时，易出现带双电荷或者多电荷的离子，其测定准确度会受到影响，同时质谱法仪器昂贵，不具有通用性。酶解法是指通过酶将PEG释放出游离的PEG，然后检测游离PEG进行推算PEG结合量，该方法缺陷在于酶解可能释放PEG不完全，受游离PEG干扰，不能直接检测修饰样品，需对修饰样品需进行纯化去除游离PEG，因而不具有通用性。
技术实现思路
为了实现上述目的，本专利技术提供了一种聚乙二醇化蛋白类药物的平均修饰度测定方法，该方法可直接检测PEG修饰蛋白中的蛋白和PEG的量来确定PEG的修饰度，克服现有技术受外界干扰大的缺陷，具有准确性高、重现性好、通用性强、可标准化的特点。为实现上述目的，本专利技术采用了如下的技术方案：聚乙二醇化蛋白类药物的平均修饰度测定方法，包括如下步骤：(1)使用与未修饰蛋白类药物标准品、聚乙二醇标准品的浓度呈线性关系的多种类型的检测器，分别建立未修饰蛋白类药物标准品、聚乙二醇标准品的浓度与其各自浓度对应的每种类型检测器响应值的标准曲线；多种检测器可以组成检测单元，检测单元包括至少两种类型检测器；其中，一种类型检测器能同时检测聚乙二醇和未修饰蛋白且聚乙二醇与未修饰蛋白的响应值互不干扰，另一种类型检测器只能检测聚乙二醇或未修饰蛋白的响应值；(2)使用步骤(1)中的检测单元中的多种类型检测器检测聚乙二醇化蛋白类药物的响应值；(3)根据步骤(2)中检测器的类型以及步骤(1)中对应类型的检测器的标准曲线分别计算聚乙二醇化蛋白类药物中聚乙二醇、蛋白的含量；(4)根据公式计算聚乙二醇化蛋白类药物的平均修饰度。未修饰蛋白类药物标准品的多个吸收值均与蛋白浓度呈线性关系；聚乙二醇标准品的多个吸收值均与聚乙二醇浓度呈线性关系；其中至少有一种类型检测器能同时响应聚乙二醇与未修饰蛋白且互不干扰。PEG修饰蛋白的PEG部分与蛋白部分互不干扰各自在相应检测器上有吸收值，可利用建立标准曲线的方法计算PEG修饰蛋白平均修饰度。本专利技术与现有技术相比，具有如下有益效果：1、方法简单，通过建立外标法，然后直接检测聚乙二醇化蛋白类药物中的聚乙二醇、蛋白的各自含量，进而计算出平均修饰度。2、通用性强，因其方法简单，易于推广，可用于检测多种聚乙二醇修饰的蛋白类药物。3、没有其他的干扰，不同于其他的检测方法，本方法内不加入其他的试剂，也不会对检测样品进行其他化学反应等破坏处理，进而提高了检测准确性。附图说明图1平均修饰度测定原理示意图；图2门冬酰胺酶(ASP)标准品不同浓度条件下(1mg/ml、0.8mg/ml、0.6mg/ml、0.4mg/ml、0.2mg/ml)SEC-HPLC-UV紫外检测图；图3门冬酰胺酶(ASP)标准品不同浓度条件下(1mg/ml、0.8mg/ml、0.6mg/ml、0.4mg/ml、0.2mg/ml)SEC-HPLC-RI示差检测图；图4聚乙二醇(PEG-5K)标准品不同浓度条件下(1.5mg/ml、1.2mg/ml、0.9mg/ml、0.6mg/ml、0.3mg/ml)SEC-HPLC-RI示差检测图；图5聚乙二醇化门冬酰胺酶(PEG-ASP)不同修饰条件下SEC-HPLC-UV紫外检测图；图6聚乙二醇化门冬酰胺酶(PEG-ASP)不同修饰条件下SEC-HPLC-RI示差检测图。具体实施方式下面通过具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明：如图1所示，聚乙二醇化蛋白类药物的平均修饰度测定方法，包括如下步骤：聚乙二醇化蛋白类药物的平均修饰度测定方法，包括如下步骤：步骤(1)使用与未修饰蛋白类药物标准品、聚乙二醇标准品的浓度呈线性关系的多种类型的检测器，分别建立未修饰蛋白类药物标准品、聚乙二醇标准品的浓度与其各自浓度对应的每种类型检测器响应值的标准曲线；多种检测器可以组成检测单元，检测单元包括至少两种类型检测器；其中，一种类型检测器能同时检测聚乙二醇和未修饰蛋白且聚乙二醇与未修饰蛋白的响应值互不干扰，另一种类型检测器只能检测聚乙二醇或未修饰蛋白的响应值；步骤(2)使用步骤(1)中的检测单元中的多种类型检测器检测聚乙二醇化蛋白类药物的响应值；步骤(3)根据步骤(2)中检测器的类型以及步骤(1)中对应类型的检测器的标准曲线分别计算聚乙二醇化蛋白类药物中聚乙二醇、蛋白的含量；步骤(4)根据公式本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.聚乙二醇化蛋白类药物的平均修饰度测定方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)使用与未修饰蛋白类药物标准品、聚乙二醇标准品的浓度呈线性关系的多种类型的检测器，分别建立未修饰蛋白类药物标准品、聚乙二醇标准品的浓度与其各自浓度对应的每种类型检测器响应值的标准曲线；多种检测器可以组成检测单元，检测单元包括至少两种类型检测器；其中，一种类型检测器能同时检测聚乙二醇和未修饰蛋白且聚乙二醇与未修饰蛋白的响应值互不干扰，另一种类型检测器只能检测聚乙二醇或未修饰蛋白的响应值；(2)使用步骤(1)中的检测单元中的多种类型检测器检测聚乙二醇化蛋白类药物的响应值；(3)根据步骤(2)中检测器的类型以及步骤(1)中对应类型的检测器的标准曲线分别计算聚乙二醇化蛋白类药物中聚乙二醇、蛋白的含量；(4)根据公式计算聚乙二醇化蛋白类药物的平均修饰度。

【技术特征摘要】
1.聚乙二醇化蛋白类药物的平均修饰度测定方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)使用与未修饰蛋白类药物标准品、聚乙二醇标准品的浓度呈线性关系的多种类型的检测器，分别建立未修饰蛋白类药物标准品、聚乙二醇标准品的浓度与其各自浓度对应的每种类型检测器响应值的标准曲线；多种检测器可以组成检测单元，检测单元包括至少两种类型检测器；其中，一种类型检测器能同时检测聚乙二醇和未修饰蛋白且聚乙二醇与未修饰蛋白的响应值互不干扰，另一种类型检测器只能检测聚乙二醇或未修饰蛋白的响应值；(2)使用步骤(1)中的检测单元中的多种类型检测器检测聚乙二醇化蛋白类药物的响应值；(3)根据步骤(2)中检测器的类型以及步骤(1)中对应类型的检测器的标准曲线分别计算聚乙二醇化蛋白类药物中聚乙二醇、蛋白的含量；(4)根据公式计算聚乙二醇化蛋白类药物的平均修饰度。2.根据权利要求1所述的聚乙二醇化蛋白类药物的平均修饰度测定方法，其特征在于：步骤(1)中检测单元包括：紫外检测器、示差折光指数检测器、蒸发光散射检测器、电雾式检测器、荧光检测器中任意两种或两种以上的组合与HPLC串联。3.根据权利要求2所述的聚乙二醇化蛋白类药物的平均修饰度测定方法，其特征在于：HPLC上串联的检测器包括UV-RI、UV-ELSD、UV-CAD中的一种。4.根据权利要求2或3所述的聚乙二醇化蛋白类药物的平均修饰度测定...

【专利技术属性】
技术研发人员：何云凤，丁琼，刘日勇，胡春兰，范开，
申请(专利权)人：重庆派金生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆,50