用于产生用于疫苗生产的病毒的方法技术

本公开涉及产生肠病毒C(Enterovirus C)，例如用于脊髓灰质炎疫苗生产的肠病毒C的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在接种所述病毒期间或接种所述病毒之前向细胞培养基中添加山梨醇和/或在固定床生物反应器中培养细胞。本文进一步提供通过本文公开的生产方法产生的肠病毒C，以及其相关的组合物、免疫原性组合物和疫苗。

A method for producing viruses for vaccine production

The present disclosure relates to methods for producing enterovirus C (Enterovirus C), such as enterovirus C for polio vaccine production. In some implementations, the method includes adding sorbitol to the cell culture medium during or before inoculation of the virus and/or culturing cells in a fixed bed bioreactor. This article further provides enterovirus C produced by the production method disclosed herein, and its related compositions, immunogenic compositions and vaccines.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于产生用于疫苗生产的病毒的方法相关申请的交叉引用本申请要求2016年9月1日申请的美国临时申请号62/382,621的权益，其通过提述以其整体并入本文。序列表的ASCII文本文件的提交下列提交的ASCII文本文件的内容通过提述以其整体并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名称：606772001240SEQLIST.txt；记录的日期：2017年8月24日，大小：2KB)。
本公开涉及用于产生用于疫苗生产的病毒(例如肠病毒C病毒)的方法。背景脊髓灰质炎是由人肠道病毒C(HEV-C)的病毒感染引起的，人肠道病毒C包含多种病毒亚型，包括几种脊髓灰质炎病毒血清型。脊髓灰质炎病毒通常通过口腔分泌物或与感染个体的粪便物质接触在人与人之间传播。大多数感染仅导致限于消化道的无症状病毒复制。然而，在不到1％的感染中，病毒感染中枢神经系统并在脊髓前角细胞的运动神经元中复制，这导致急性弛缓性麻痹，且在某些情况下难以说话、吞咽、呼吸并死亡。仅在美国，每年都有数万人感染脊髓灰质炎，直到1955年JonasSalk开发出一种灭活的脊髓灰质炎疫苗。后来AlbertSabin使用减毒病毒开发了一种口服脊髓灰质炎疫苗(OPV)。这些导致人类几乎消灭了脊髓灰质炎；然而，2012年报道了223例麻痹性脊髓灰质炎(Sutter,R.W.等人(2014)J.Infect.Dis.210:S434-S438)。脊髓灰质炎在尼日利亚、阿富汗和巴基斯坦仍然流行，且在中东、非洲和亚洲的不同国家都发生了零星的爆发。人肠道病毒C属于无包膜正义RNA病毒的小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)，其还包括某些鼻病毒(rhinovirus)和某些柯萨奇病毒(coxsackievirus)。HEV-C组的成员包括三种脊髓灰质炎病毒血清型(S1、S2和S3；也称为PV1、PV2和PV3)和许多柯萨奇A病毒血清型(例如，CAV血清型1、11、13、15、17、18、19、20、21、22和24)(Brown,B.等人(2003)J.Virol.77:8973-84)。虽然认为野生脊髓灰质炎病毒血清型2(WPV2)已被消灭(最后一次已知的感染发生在1999年)，WPV3感染最后一次发生于2012年，但WPV1感染仍有报告(Lowther,S.A.(2013)MorbidityandMortalityWeeklyReport62:335-8)。脊髓灰质炎病毒包含二十面体衣壳，每个衣壳蛋白由VP1、VP2、VP3和VP4各60个拷贝组成。病毒与特异性脊髓灰质炎病毒受体(Pvr，也称为CD155)的结合导致所有三种病毒血清型的细胞感染。然而，这些血清型包含被中和抗体识别的血清型特异性免疫显性表位和一般免疫显性表位(Minor,P.D.等人(1986)J.Gen.Virol.67:1283-91)。灭活的脊髓灰质炎疫苗包含每种血清型的福尔马林灭活的野生型菌株。Sabin口服脊髓灰质炎疫苗包含三种活的减毒的脊髓灰质炎病毒血清型的混合物，但是针对每种脊髓灰质炎病毒血清型的单价疫苗也用于减少特定血清型的传播。然而，已经显示这些减毒病毒可获得神经毒力和传播力，这导致由于循环疫苗衍生的脊髓灰质炎病毒(cVDPV)引起的爆发。由于这些爆发以及由于消灭不彻底而导致的野生脊髓灰质炎病毒的持续爆发，因此需要继续生产脊髓灰质炎疫苗。工业规模的病毒疫苗生产需要大量资源和成本。为了生产潜在的疫苗，病毒疫苗通常由锚定依赖性细胞系(例如VERO细胞)产生。在工业规模上，这些细胞在滚瓶上的多板系统(例如，“细胞工厂”(CellFactories)、“细胞立方体”(CellCube)等)中以静态模式培养，或者在生物反应器中悬浮的微载体(多孔或无孔)培养。多板系统体积庞大并且需要大量的处理操作，而微载体培养需要从预培养到具有复杂操作(即珠子到珠子的转移)的最终工艺的许多操作(载体的灭菌和水化等)和许多步骤。一旦产生病毒，用于下游纯化的现有方案通常是繁重且资源密集的。例如，美国专利号8,753,646描述了用于脊髓灰质炎病毒纯化的方案，其包括多个过滤和超速离心步骤，最后进行基于柱的病毒纯化。每个额外步骤都需要人力、时间和资源。因此，需要使用更简化的下游纯化方案的疫苗生产技术，这将允许简单、更短的工艺，该工艺减少占地面积，人力和操作成本。脊髓灰质炎病毒仍然流行的非洲和中东的几个地区仍然需要脊髓灰质炎疫苗。然而，这些地区在经济上处于不利地位，缺乏有效的疫苗接种计划的充足资源和/或基础设施。因此，消灭脊髓灰质炎需要更多的成本和资源有效的病毒生产方法。简述因此，需要开发用于肠病毒C生产的方法，例如，允许工业规模上的成本高效的病毒生产的方法。如本文所公开的，本公开的方法，除其他事项之外，使用固定床培养系统以实现增加的病毒生产，具有更高的成本效益和简化的流程。例如，本文描述的改进能够将疫苗的每剂量成本从大约5美元降低到1.25美元。在一些实施方案中，本公开的方法可以另外地或替代地包括在用病毒接种细胞期间或之前向细胞培养基中添加聚山梨醇酯。有利地，这些方法可用于(例如)肠病毒C的大规模或工业规模生产，生产的肠病毒C可用于制备疫苗和/或免疫原性组合物。因此，本公开的某些方面提供了用于产生肠病毒C病毒的方法，其包括：(a)在第一细胞培养基中培养细胞；(b)在肠病毒C病毒可感染细胞且感染的细胞可产生肠病毒C病毒的条件下，在第二细胞培养基中用肠病毒C病毒接种所述细胞；且(c)收获由所述细胞产生的肠病毒C病毒，其中在用肠病毒C病毒接种所述细胞期间或在步骤(c)之前约一小时至约四小时向所述第二细胞培养基添加表面活性剂。在一些实施方案中，与缺少所述表面活性剂时收获的肠病毒C病毒的产量相比，步骤(c)中收获的肠病毒C病毒的产量增加。在一些实施方案中，与缺少所述表面活性剂时收获的肠病毒C病毒的产量相比，步骤(c)中收获的肠病毒C病毒的产量增加了约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍或约10倍。在一些实施方案中，所述表面活性剂是聚山梨醇酯。在一些实施方案中，所述表面活性剂是基于聚乙二醇的表面活性剂。本公开的其他方面提供用于产生肠病毒C病毒的方法，其包括：(a)在第一细胞培养基中培养细胞；(b)在肠病毒C病毒可感染细胞且感染的细胞可产生肠病毒C病毒的条件下，在第二细胞培养基中用肠病毒C病毒接种所述细胞；且(c)收获由所述细胞产生的肠病毒C病毒，其中在用肠病毒C病毒接种所述细胞期间或在步骤(c)之前约一小时至约四小时向所述第二细胞培养基添加葡聚糖。在一些实施方案中，与缺少所述葡聚糖时收获的肠病毒C病毒的产量相比，步骤(c)中收获的肠病毒C病毒的产量增加。在一些实施方案中，与缺少所述葡聚糖时收获的肠病毒C的产量相比，步骤(c)中收获的肠病毒C的产量增加约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍或约10倍。在一些实施方案中，所述肠病毒C病毒是选自下组的脊髓灰质炎病本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于产生肠病毒C病毒的方法，包括：(a)在第一细胞培养基中培养细胞；(b)在肠病毒C病毒可感染所述细胞且感染的细胞可产生肠病毒C病毒的条件下，在第二细胞培养基中用肠病毒C病毒接种所述细胞；且(c)收获由细胞产生的肠病毒C病毒，其中在用肠病毒C病毒接种细胞期间或在步骤(c)之前约一小时至约四小时向第二细胞培养基添加表面活性剂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.09.01 US 62/382,6211.一种用于产生肠病毒C病毒的方法，包括：(a)在第一细胞培养基中培养细胞；(b)在肠病毒C病毒可感染所述细胞且感染的细胞可产生肠病毒C病毒的条件下，在第二细胞培养基中用肠病毒C病毒接种所述细胞；且(c)收获由细胞产生的肠病毒C病毒，其中在用肠病毒C病毒接种细胞期间或在步骤(c)之前约一小时至约四小时向第二细胞培养基添加表面活性剂。2.权利要求1的方法，其中与没有所述表面活性剂时收获的肠病毒C病毒的产率比较，步骤(c)中收获的肠病毒C病毒的产率增加。3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯。4.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述表面活性剂是基于聚乙二醇的表面活性剂。5.一种用于产生肠病毒C病毒的方法，包括：(a)在包含基质的固定床中培养贴壁细胞，其中所述细胞在第一细胞培养基中培养；(b)在肠病毒C病毒可感染所述细胞且感染的细胞可产生肠病毒C病毒的条件下，在第二细胞培养基中用肠病毒C病毒接种所述细胞；其中以约0.01至约0.0009的MOI用所述肠病毒C病毒接种所述细胞；和(c)收获由所述细胞产生的肠病毒C病毒。6.一种用于产生肠病毒C病毒的方法，包括：(a)在包含基质的固定床中培养贴壁细胞，其中所述细胞在第一细胞培养基中培养；(b)在肠病毒C病毒可感染所述细胞且感染的细胞可产生肠病毒C病毒的条件下，在第二细胞培养基中用肠病毒C病毒接种所述细胞，其中约100,000个细胞/cm2至300,000个细胞/cm2被接种；和(c)收获由所述细胞产生的肠病毒C病毒。7.一种用于产生肠病毒C病毒的方法，其包括：(a)在包含基质的固定床中培养贴壁细胞，其中所述细胞在第一细胞培养基中培养；(b)在肠病毒C病毒可感染所述细胞且感染的细胞可产生肠病毒C病毒的条件下，在第二细胞培养基中用肠病毒C病毒接种所述细胞；和(c)收获由所述细胞产生的肠病毒C病毒，其中在步骤(a)和/或步骤(b)期间以约0.1mL/cm2至约0.3mL/cm2的体积/表面积比培养所述细胞。8.一种用于产生肠病毒C病毒的方法，包括：(a)在包含基质的固定床中培养贴壁细胞，其中所述细胞在第一细胞培养基中培养；(b)在肠病毒C病毒可感染所述细胞且感染的细胞可产生肠病毒C病毒的条件下，在第二细胞培养基中用肠病毒C病毒接种所述细胞，其中在约6.8至约7.4范围的pH接种所述细胞；和(c)收获由所述细胞产生的肠病毒C病毒。9.一种用于产生肠病毒C病毒的方法，包括：(a)在包含基质的固定床中培养贴壁细胞，其中所述细胞在第一细胞培养基中培养；(b)在肠病毒C病毒可感染所述细胞且感染的细胞可产生肠病毒C病毒的条件下，在第二细胞培养基中用肠病毒C病毒接种所述细胞，其中无额外的葡萄糖添加至所述第二细胞培养基和/或从所述第二培养基中耗竭葡萄糖；和(c)收获由所述细胞产生的肠病毒C病毒。10.一种用于产生纯化的肠病毒C病毒的方法，其包括：(a)在包含基质的固定床中培养贴壁细胞，其中所述细胞在第一细胞培养基中培养；(b)在肠病毒C病毒可感染所述细胞且感染的细胞可产生肠病毒C病毒的条件下，在第二细胞培养基中用肠病毒C病毒接种所述细胞；(c)收获由所述细胞产生的肠病毒C病毒；(...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·饶，佐藤达记，小田香织，中村邦明，西滨刚志，
申请(专利权)人：武田疫苗股份有限公司，武田药品工业株式会社，
类型：发明
国别省市：美国,US