脯氨酸光学探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种脯氨酸光学探针及其制备方法和应用。一方面，本发明专利技术涉及一种光学探针，包含脯氨酸敏感多肽或其功能变体和光学活性多肽或其功能变体，其中光学活性多肽或其功能变体位于脯氨酸敏感多肽或其功能变体的序列内。本发明专利技术也涉及上述探针的制备方法及其在检测脯氨酸中的应用。

Proline optical probe and its preparation and Application

The invention relates to a proline optical probe, a preparation method and application thereof. On the one hand, the present invention relates to an optical probe comprising proline sensitive polypeptide or its functional variant and optical active polypeptide or its functional variant, in which the optical active polypeptide or its functional variant is located in the sequence of proline sensitive polypeptide or its functional variant. The invention also relates to the preparation method of the probe and its application in the detection of proline.

【技术实现步骤摘要】
脯氨酸光学探针及其制备方法和应用
本专利技术涉及光学探针
，尤其涉及一种脯氨酸光学探针及其制备方法和应用。
技术介绍
脯氨酸作为20种天然氨基酸之一，广泛的分布于各种动植物中。在植物体中，脯氨酸积累是一个非常常见并且重要的现象。当植物受到外界环境的危害时，植物体内的脯氨酸含量会发生剧烈增加，这一现象产生的机制以及其在植物体中的生理作用仍然没有被研究清楚。而在哺乳动物细胞中，脯氨酸作为一个非必须氨基酸其生理作用在一开始并没有被广泛的认知，仅仅是作为一个蛋白质合成的原料并且由于其结构的特殊使其对蛋白质的骨架结构的维持有着重要的作用。但近年来，随着脯氨酸代谢通路对于细胞内ROS的调控作用的发现，人们逐渐的又将目光重新的聚焦到了哺乳动物细胞中脯氨酸及其代谢通路的研究上。哺乳动物中脯氨酸代谢主要是在细胞胞质和线粒体中进行的，主要是脯氨酸通过线粒体上的转运蛋白质进入线粒体中，通过线粒体内膜上的一个脯氨酸氧化酶(POX/PRODH)将脯氨酸氧化脱氢后生成Δ1-吡咯啉-5-羧酸(P5C)，而P5C穿梭回胞质并且通过胞质中的PYCR(P5C还原酶)转变回脯氨酸。这样就形成了一个脯氨酸代谢的循环。Δ1-吡咯啉-5-羧酸(P5C)在胞质中可以与GSA(谷氨酸-γ-半醛)形成一个互变异构平衡，最后GSA一方面可以通过P5CDH脱氢生成谷氨酸进入三羧酸循环进行代谢而另一方面则是可以通过鸟氨酸转氨酶生成鸟氨酸进入尿素循环进行代谢。总的来说就是POX和PYCR(P5CDH)对P5C和脯氨酸在胞质和线粒体之间的相互转化的调节形成的代谢通路我们称之为脯氨酸循环(LiuW等，Biofactors.2012,38(6):398-406；LiuW等Autophagy.2012,8(9):1407-1409；LiuW等，CancerRes.2012,72(14):3677-3686)。近年来研究发现脯氨酸氧化酶(POX)基因能通过促进细胞周期停滞、诱导细胞分化及促进细胞的凋亡等途径负性调节肿瘤细胞的生长，并在多种肿瘤中发现其表达的异常。脯氨酸在POX的作用下氧化脱氢生成P5C的同时也消耗ADP产生ATP以及一个自由电子，该电子在线粒体内的电子呼吸链中传递的过程中伴随着ROS(反应活性氧)的生成，而ROS则是对细胞的凋亡，增殖以及细胞周期有着至关重要的调控(LiuY等，CancerRes.2009,69(16):6414-6422；PhangJM等，SzabadosL等，TrendsPlantSci.2010,15(2):89-97；PandhareJ等，JBiolChem.2006,281(4):2044-2052；LiuY等，Oncogene.2006,25(41):5640-5647)。正是由于脯氨酸具有上述重要的作用，因此脯氨酸含量的检测也尤为重要。脯氨酸的常用检测方法包括酸性茚三酮显色法(Chen等,ApplieEnvironmentalMicrobiology2006,72:4001–4006)、分光光度计(HortalaMA等，JAmChemSo2003,125(1):20-21；PuF等，AnalChem2010,82(19):8211-8216)、高效液相色谱法(WadudS等，JournalofchromatographyB,Analyticaltechnologiesinthebiomedicalandlifesciences2002,767(2):369-374)等。但是这些方法并不适用于活细胞研究，存在很多缺陷：需要经过耗时的样品处理过程，例如细胞破碎、分离提取纯化等；不能在活细胞和亚细胞器中进行原位、实时、动态、高通量和高时空分辨率的检测。本领域仍需要能在细胞内、外实时定位、定量、高通量检测脯氨酸的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供在细胞内、外实时定位、高通量、定量检测脯氨酸的探针和方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供一种脯氨酸光学探针，包含脯氨酸敏感多肽或其功能变体和光学活性多肽或其功能变体，其中光学活性多肽或其功能变体位于脯氨酸敏感多肽或其功能变体的序列内。脯氨酸敏感多肽或其功能变体被光学活性多肽或其功能变体分为第一部分和第二部分。在一个实施方式中，本专利技术光学探针对脯氨酸敏感。本专利技术提供了一种脯氨酸光学探针，包括脯氨酸敏感多肽B和光学活性多肽A，其中光学活性多肽A位于脯氨酸敏感多肽B的序列内，将脯氨酸敏感多肽B分为第一部分B1和第二部分B2，形成B1-A-B2式的探针结构。在一个实施方式中，脯氨酸敏感多肽包括脯氨酸结合蛋白或其功能变体。在一个实施方式中，脯氨酸结合蛋白源自农杆菌，例如Agrobacteriumfabrum。在一个实施方式中，脯氨酸结合蛋白源自Atu2422-GABA受体蛋白或其类似物。在一个实施方式中，脯氨酸结合蛋白包括Atu2422-GABA受体蛋白或其功能变体。在一个具体实施方式中，脯氨酸结合蛋白具有SEQIDNO:1所示的序列或其功能变体，或与其有35％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％序列相同性的序列。在一个实施方式中，光学活性多肽是荧光蛋白或其功能变体。在一个实施方式中，荧光蛋白选自黄色荧光蛋白(如SEQIDNO:2所示的cpYFP)、橘黄色荧光蛋白(如SEQIDNO:3所示的cpmOrange)、红色荧光蛋白(如SEQIDNO:4或8所示的mKate，如SEQIDNO:5所示的mcherry)、绿色荧光蛋白(如SEQIDNO:6所示的cpGFP)、蓝色荧光蛋白(如SEQIDNO:7所示的cpBFP)、苹果红荧光蛋白(如SEQIDNO:9所示的cpmApple)。优选地，光学活性多肽是cpYFP。在一个实施方式中，荧光蛋白具有SEQIDNO:2-9中任一所示的序列。在一个实施方式中，光学探针还包含侧接所述光学活性多肽的一个或多个接头。本专利技术所述接头可以是任何长度的任何氨基酸序列。在一个实施方式中，光学活性多肽侧翼包含不超过5个氨基酸的接头，例如0、1、2、3、4个氨基酸的接头。在一个实施方式中，接头位于光学活性多肽的N端和/或C端。在一个实施方式中，本专利技术光学探针不包含接头。在一个实施方式中，光学探针如下所示：脯氨酸敏感多肽的第一部分B1-光学活性多肽A-脯氨酸敏感多肽的第二部分B2。在一个实施方式中，本专利技术光学探针还包含定位序列，用于将探针定位到例如细胞的特定细胞器。本专利技术所述光学活性多肽可以位于或融合到脯氨酸敏感多肽的任何位置。在一个实施方式中，光学活性多肽位于脯氨酸敏感多肽的选自以下的区段内：残基117-123、残基249-259和残基323-330，编号对应于脯氨酸敏感多肽的全长。在一个实施方式中，光学活性多肽置换脯氨酸敏感多肽的选自以下的区段内的一个或多个氨基酸：残基117-123、残基249-259和残基323-330，编号对应于脯氨酸敏感多肽的全长。在一个实施方式中，光学活性多肽位于脯氨酸敏感多肽的选自以下的位点：117/118，117/119，117/120，117/121，118/119，118/120，118/121，119/120，119/121，120/121，120/122，12本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脯氨酸敏感多肽或其功能变体，其中脯氨酸敏感多肽在SEQ ID NO:1所示的序列，或与其有35％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％序列相同性的序列中包含选自以下位点处的突变：F77，A100，T102，D121，Y150，D226和Y275。

【技术特征摘要】
1.一种脯氨酸敏感多肽或其功能变体，其中脯氨酸敏感多肽在SEQIDNO:1所示的序列，或与其有35％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％序列相同性的序列中包含选自以下位点处的突变：F77，A100，T102，D121，Y150，D226和Y275。2.一种光学探针，包含脯氨酸敏感多肽或其功能变体和光学活性多肽或其功能变体，其中光学活性多肽或其功能变体位于脯氨酸敏感多肽或其功能变体的序列内，所述脯氨酸敏感多肽包含选自以下位点处的突变：F77，A100，T102，D121，Y150，D226和Y275，编号对应于脯氨酸敏感多肽的全长。3.如权利要求2所述的光学探针，其中，所述脯氨酸敏感多肽在SEQIDNO:1所示的序列，或与其有35％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％序列相同性的序列中包含选自以下位点处的突变：F77，A100，T102，D121，Y150，...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨弋，赵玉政，李写，徐磊，王巧慧，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海,31