一种重组病毒样颗粒及其制备方法和用途技术

本发明专利技术提供了一种重组病毒样颗粒及其制备方法和用途，所述方法包括如下步骤：将表达重组病毒衣壳蛋白的细胞进行发酵后收集发酵产物，采用2‑6M的脲溶液溶解解聚，胞外二次组装得到重组病毒衣壳蛋白的完整病毒样颗粒。本发明专利技术的重组乙肝病毒核心抗原颗粒的制备方法，将硫酸铵沉淀的重组衣壳蛋白在相对温和条件下溶解并解聚、纯化、最后胞外二次组装形成具有天然结构的病毒样颗粒。该方法简单、高效，所制备的重组乙肝病毒核心抗原颗粒具有结构完整、均一且不含宿主核酸和杂蛋白的优点，具有重要意义和广阔的应用前景。

A recombinant virus-like particle and its preparation method and Application

The invention provides a recombinant virus-like particle and its preparation method and application. The method comprises the following steps: the cells expressing recombinant virus capsid protein are fermented, the fermentation products are collected, dissolved and depolymerized in 2 6M urea solution, and the complete virus-like particles of recombinant virus capsid protein are obtained by extracellular secondary assembly. The preparation method of the recombinant hepatitis B virus core antigen particle of the invention dissolves the recombinant capsid protein precipitated by ammonium sulfate under relatively mild conditions, depolymerizes, purifies and finally assembles the recombinant capsid protein to form a virus-like particle with natural structure. The method is simple and efficient. The prepared recombinant hepatitis B virus core antigen particles have the advantages of complete structure, homogeneity and no host nucleic acid and heteroprotein. It has important significance and broad application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种重组病毒样颗粒及其制备方法和用途
本专利技术属于生物医药
，涉及一种重组病毒样颗粒及其制备方法和用途，主要涉及一种可溶形式表达的重组病毒样颗粒及其制备方法和用途，具体涉及一种重组乙肝病毒核心抗原颗粒及其制备方法和用途。
技术介绍
乙肝病毒核心抗原(HBc)是单链衣壳蛋白，可独自组成无核酸的正二十面体结构，具有与天然病毒类似的形态，大小约28nm。其主要免疫显性区域(MIR)位于颗粒的表面形成刺突，能够有效的递呈抗原，激发强烈的体液免疫和细胞免疫。此外在其MIR区插入或替换为一段其它抗原，并不会影响其形成病毒样球形颗粒结构。这些优点使得HBc成为病毒样颗粒(VLP)中最具有用途前景的疫苗载体。另一方面不含核酸的HBc-VLP纳米尺寸的空心结构能够高效装载小分子药物或者显影剂，在药物递送和临床诊断方面具有广阔的用途前景。目前，HBc-VLP已经在重组真核细胞和原核细胞中成功获得表达，前者如非洲爪蟾蛙卵母细胞、植物本氏烟以及毕赤酵母等，后者如大肠杆菌。由于病毒样颗粒结构的复杂性，传统制备多采用真核表达系统进行培养表达，利用高等细胞自身的蛋白加工能力，在胞内完成颗粒组装，然后以组装体的形式与宿主的其它杂质分离。但这种制备策略存在以下问题：一是胞内组装的颗粒存在结构不均一、颗粒不完整的现象，无论是由非洲爪蟾蛙细胞、植物还是酵母细胞表达，其产物除完整颗粒外，还存在大量的二聚体、组装中间体甚至是错误组装的结构，导致直接纯化后的疫苗质量低，活性低，且易于聚集稳定性低。二是纯化过程容易破坏颗粒组装体结构，由于颗粒组装体蛋白间的作用力较弱，与介质吸附洗脱的相互作用会对组装体的结构造成破坏，使部分颗粒解聚，导致纯化收率及活性大幅降低。三是部分杂质不易除去，直接纯化的疫苗产品存在安全隐患，无论对哺乳动物细胞还是昆虫细胞，在胞内进行组装时很容易将宿主DNA或RNA以及宿主蛋白包裹于内部，胞内组装的蛋白颗粒还可能和宿主蛋白结合在一起。为了去除此类杂质，均需要打开宿主蛋白与颗粒的结合以及打开原有颗粒结构，这必然会对完整组装体的结构带来改变和破坏，以至于颗粒完全解聚。与一级氨基酸序列决定蛋白空间构象相同，病毒衣壳蛋白的独特理化性质决定了衣壳蛋白具有在胞外自组装成病毒样颗粒的能力。采用先纯化亚基单元后组装颗粒能避免层析过程对组装体结构的破坏，能彻底去除宿主核酸等杂质，通过胞外二次组装还能显著改善颗粒形貌，提高均一性等，因此采用胞外自组装方法有望解决传统疫苗制备出现的上述问题。已有文献报道，大肠杆菌表达的重组HBc蔗糖梯度密度离心结果显示超离样品中HBc沉降系数呈现非常宽的分布，存在大量的二聚体等未组装结构，表明产物结构的严重不均一。因此HBc-VLP的制备采取胞外自组装技术是非常必要的，以期达到高效、纯净、颗粒完整、结构均一的目的。“Wizemann,H.andBrunn,A.V.,PurificationofE.coli-expressedHIS-taggedhepatitisBcoreantigenbyNi2+-chelateaffinitychromatography,JournalofVirologicalMethods,1999,189-197”公开了一种体外组装病毒样颗粒的方法，截短的HBc-VLP能够在2M脲，pH9.5条件下解聚，NiFF纯化后组装得到VLP，遗憾的是，这种方法无论是纯化还是组装均收率较低，最后的产品质量也不高。CN101848730A公开了将上述方法用于融合HBc-VLP的制备，主要是在变性剂尿素或盐酸胍存在条件下纯化，然后再重组装形成VLP，但现有方法不能得到与天然结构相似的类病毒样HBc颗粒。病毒样颗粒的结构对其应用有着重要的影响，因此，提供一种操作简单、收率高、纯化效果好，病毒样颗粒结构均一完整的重组病毒样颗粒制备方法具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供一种重组病毒样颗粒及其制备方法和用途，本专利技术的重组病毒样颗粒不含宿主核酸，纯度高且结构完整均一，与天然病毒形态完全相同，制备方法简单，收率高，纯化效果好，具有重要意义和广泛应用前景。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种重组病毒样颗粒的制备方法，所述方法包括如下步骤：将表达重组病毒衣壳蛋白的细胞进行发酵后收集发酵产物，采用2-6M的脲溶液溶解解聚，胞外二次组装得到重组病毒衣壳蛋白的完整病毒样颗粒。本专利技术中，通过基因重组技术表达乙肝病毒核心抗原，发酵产物中包含完整病毒样颗粒的同时也包含大量不完整的病毒样颗粒，直接纯化发酵产物收率低，得到的病毒样颗粒活性差，包含核酸存在安全隐患，严重影响后续应用，本专利技术采用2-6M的脲溶液，溶解解聚发酵产物中完整及不完整的病毒样颗粒，在所述脲浓度范围内既可以重悬解聚所有病毒样颗粒，同时不会引起抗原蛋白的二三级空间构象破坏，为胞外二次组装做准备。脲浓度过低不能有效解聚病毒样颗粒，而脲浓度过高，容易改变蛋白的二级、三级结构，产生疏水聚集，不能再进行胞外组装，或者组装成的颗粒结构不同于天然病毒颗粒，丧失其应用意义。优选地，所述重组病毒衣壳蛋白包括重组乙肝病毒核心抗原。本专利技术的方法适用于所有以可溶形式表达的重组病毒样颗粒，尤其适用于重组乙肝病毒核心抗原颗粒。优选地，所述重组乙肝病毒核心抗原包括重组乙肝病毒核心抗原的截短体和/或含有其他抗原的重组乙肝病毒核心抗原全长。优选地，所述截短体与其他抗原融合表达。优选地，所述重组乙肝病毒核心抗原全长与其他抗原融合表达。本专利技术的方法尤其适用于胞外二次组装重组乙肝病毒核心抗原颗粒，其中，可以直接将乙肝病毒核心抗原截短后进行表达，也可以将乙肝病毒核心抗原的全长或其截短体与其他抗原表位进行基因融合后表达。优选地，所述重组使用的重组蛋白表达系统包括真核表达系统和/或原核表达系统。优选地，所述真核表达系统包括非洲爪蟾蛙卵母细胞、植物本氏烟或毕赤酵母中的任一种或至少两种的组合。优选地，所述原核表达系统包括大肠杆菌。优选地，所述脲溶液的浓度为3.5-4.5M，优选为4M。本专利技术中，脲溶液的终浓度在3.5-4.5M范围内，可有效解聚发酵产物中的病毒样颗粒，有利于提高后续蛋白的纯化收率和纯度，而且不影响胞外二次组装的效率。优选地，所述脲溶液的pH值为7.0-9.0，例如可以是7.0、7.2、7.5、7.8、8.0、8.2、8.5、8.8或9.0。本专利技术中，脲溶液的pH为中性或弱碱性，pH值过低不能有效解聚发酵产物，pH值过高容易引起蛋白变性，只有在所述pH值范围内，配合本专利技术的制备工艺，才能得到结构完整均一的病毒样颗粒。优选地，所述收集发酵产物具体包括如下步骤：(1)破碎细胞，离心收集上清；(2)上清中加入硫酸铵溶液，搅拌，离心收取沉淀，得到所述发酵产物。优选地，步骤(1)所述破碎细胞的方式包括超声破碎和/或高压匀浆。优选地，步骤(2)所述的硫酸铵溶液终浓度为0.05-4M，例如可以是0.05M、0.1M、0.2M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1M、1.5M、2M、2.5M、3M、3.5M或4M，优选为0.1-1M。优选地，步骤(2)所述硫酸铵溶液pH值为7.0-8.0，例如可以是7.0、7.2、7.4、7.6本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将表达重组病毒衣壳蛋白的细胞进行发酵后收集发酵产物，采用2‑6M的脲溶液溶解解聚，胞外二次组装得到重组病毒衣壳蛋白的完整病毒样颗粒。

【技术特征摘要】
1.一种重组病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将表达重组病毒衣壳蛋白的细胞进行发酵后收集发酵产物，采用2-6M的脲溶液溶解解聚，胞外二次组装得到重组病毒衣壳蛋白的完整病毒样颗粒。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组病毒衣壳蛋白包括重组乙肝病毒核心抗原；优选地，所述重组乙肝病毒核心抗原包括重组乙肝病毒核心抗原的截短体和/或含有其他抗原的重组乙肝病毒核心抗原全长；优选地，所述截短体与其他抗原融合表达；优选地，所述重组乙肝病毒核心抗原全长与其他抗原融合表达；优选地，所述重组使用的重组蛋白表达系统包括真核表达系统和/或原核表达系统；优选地，所述真核表达系统包括非洲爪蟾蛙卵母细胞、植物本氏烟或毕赤酵母中的任一种或至少两种的组合；优选地，所述原核表达系统包括大肠杆菌。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述脲溶液的浓度为3.5-4.5M，优选为4M；优选地，所述脲溶液的pH值为7.0-9.0。4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述收集发酵产物具体包括如下步骤：(1)破碎细胞，离心收集上清；(2)上清中加入硫酸铵溶液，搅拌，离心收取沉淀，得到所述发酵产物。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述破碎细胞的方式包括超声破碎和/或高压匀浆；优选地，步骤(2)所述的硫酸铵溶液终浓度为0.05-4M，优选为0.1-1M；优选地，步骤(2)所述的硫酸铵溶液pH值为7.0-8.0；优选地，步骤(2)所述搅拌的温度为1-6℃，优选为4℃。6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述胞外二次组装包括如下步骤：(1’)纯化解聚后的组装单元；(2’)透析降低脲浓度，调节组装缓冲溶液的pH值、离子强度、蛋白质浓度、温度和时间，通过胞外组装得到重组病毒衣壳蛋白的完整病毒样颗粒。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1’)所述纯化的方法包括亲和层析、离子交换或凝胶过滤，优选为亲和层析；优选地，所述亲和层析的介质包括镍离子金属螯合亲和层析介质和肝素亲和层析介质；优选地，步骤(2’)所述降低脲浓度采用梯度透析的方式；优选地，所述梯度透析具体包括如下步骤：将步骤(1’)得到的解聚后的样品透析至Tris透析缓冲液中，再透析至组装缓冲液中；优选地，所述Tris透析缓冲液包括Tris-HCl和脲；优选地，所述Tris透析缓冲液中的脲的终浓度不大于2M；优选地，所述Tris透析缓冲液的pH值为8.0-9.0；优选地，步骤(2’)所述组装缓冲液包括Tris-HCl；优选地，所述组装缓冲液还包括NaCl；优选地，所述NaCl的终浓度为0.2-1.5M，优选为0.5M；优选地，步骤(2’)所...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘永东，苏志国，张耀，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11