一种纯化HBc-VLPs或HBc-VLPs衍生物的方法技术

本发明专利技术提供了一种纯化HBc‑VLPs或HBc‑VLPs衍生物的方法，所述方法为：将含有HBc‑VLPs的菌液或HBc‑VLPs衍生物的菌液，依次经过第一次热处理和第二次热处理后，得到纯化的HBc‑VLPs或纯化的HBc‑VLPs衍生物；本发明专利技术提供的纯化方法，通过两步梯度加热，解决了目前通用的一步加热法，面临杂蛋白去除率低与杂蛋白可能进入病毒样颗粒内部造成产品污染的问题，确保产品的质量好，纯度高，经过精制等手段最终可使得产品纯度可达到99％以上，收率可达到77％左右，具有较大的实际应用价值和工业推广前景。

A Method for Purifying HBc-VLPs or HBc-VLPs Derivatives

The invention provides a method for purifying HBc_VLPs or HBc_VLPs derivatives. The method comprises the following steps: purifying HBc_VLPs or purified HBc_VLPs derivatives by first and second heat treatments of bacterial liquid containing HBc_VLPs or bacterial liquid containing HBc_VLPs derivatives; and the method for purifying HBc_VLPs or purified HBc_VLPs derivatives by the present invention solves the problem by two-step gradient heating. With one-step heating method, the problem of low removal rate of impurity proteins and possible contamination of products caused by impurity proteins entering virus-like particles is faced. The quality and purity of products are ensured to be good. After refining, the purity of products can reach more than 99% and the yield can reach about 77%. This method has great practical application value and industrial popularization prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种纯化HBc-VLPs或HBc-VLPs衍生物的方法
本专利技术属于生化分离领域，涉及一种纯化HBc-VLPs或HBc-VLPs衍生物的方法，尤其涉及一种使用二次梯度加热法纯化HBc-VLPs或HBc-VLPs衍生物的方法。
技术介绍
乙型肝炎病毒核心抗原(HepatitisBviruscoreantigen，HBcAg)由183个氨基酸组成，相对分子质量为21000Da，在真核及原核表达系统中表达时，均能自我装配形成病毒样颗粒(Virus-likeparticles，VLPs)，呈正二十面体对称的颗粒结构。HBcAg作为一种VLP，不仅自身具有很强的免疫原性，而且可以作为疫苗载体，在其C端、N端以及免疫原区(MIR)均可以插入外源片段而不影响其组装的正确性。HBc-VLP为载体的疫苗如口蹄疫疫苗，疟疾疫苗等均取得了良好的效果，另外，HBc-VLP由于具有空壳结构，也可以用来包裹核酸以及其他的小分子物质。乙肝核心抗原病毒样颗粒(HBc-VLPs)作为一种研究广泛的病毒样颗粒，纯化技术在其研究与应用进程中发挥着至关重要的作用。病毒样颗粒为基础的疫苗，由多个亚基自组装而成，与其他种类的疫苗纯化相比，纯化过程不仅要去除宿主蛋白，宿主DNA，内毒素等杂质，还需要去除未正确组装的VLPs，这就为病毒样颗粒的纯化带来了新的挑战。传统纯化方法主要包括硫酸铵沉淀、超滤除杂、PEG沉淀等。这些方法难以获得高纯度的HBc-VLPs。密度梯度离心是目前实验室制备HBc-VLPs采用较多的方法，采用梯度离心，不仅可以达到较高的纯度，而且可以保持颗粒的结构与免疫原性，但是梯度离心处理量有限，同时操作成本也比较高，难以应用于工业规模化生产。色谱技术具有分离效率高，应用范围广，易于放大等优点，其已经成功应用于多种VLPs的纯化。目前，利用层析技术发展了一种完整的HBc-VLP的纯化工艺(Expression,purificationandcharacterizationoffull-lengthRNA-freehepatitisBcoreparticles,ProteinExpressionandPurification,54(2007)30-37)，但其涉及离子交换层析，凝胶过滤层析以及亲和层洗，步骤繁多，收率很低，不足10％。另外，利用离子填料的扩张床吸附HBc-VLPs达到分离纯化的目的(DirectpurificationofrecombinanthepatitisBcoreantigenfromtwodifferentpre-conditionedunclarifiedEscherichiacolifeedstocksviaexpandedbedadsorptionchromatography,JournalofChromatographyA,1172(2007)47-56)；还有研究利用离子交换穿透式层析除去体系中的杂蛋白提纯HBc-VLPs(NegativechromatographypurificationofhepatitisBvirus-likeparticlesusingpoly(oligo(ethyleneglycol)methacrylate)graftedcationicadsorbent,JournalofChromatographyA,1415(2015)161-165；NegativechromatographyofhepatitisBvirus-likeparticle:Comparativestudyofdifferentadsorbentdesigns,JournalofChromatographyA,1445(2016)1-9)，但是由于离子交换填料由于其配基与颗粒之间存在较强的相互作用力，可能导致大颗粒结构的破坏，往往收率是比较低的。另外，CN102199217B公开了一种采用Ni2+亲和层析纯化方法来纯化乙型肝炎病毒多表位融合蛋白。亲和色谱的载体一般较为昂贵，机械强度不够高，因此不能耐受高压，而且在洗脱的过程中，配基会发生脱落并进入分离体系，给纯化造成额外的负担。因此，HBc-VLPs的纯化仍然是限制其应用的瓶颈问题，发展一种规模化制备的技术是当务之急。由于HBc-VLPs具有较高的热稳定性，通过对细胞破碎液进行加热，以沉淀除去部分热不稳定的宿主蛋白以及细胞碎片，可以降低后续层析纯化的负担。例如，利用加热的方法直接处理未澄清的细菌破碎原液，再经过进一步的离子交换层析纯化，使目的蛋白的收率和纯度都得到了一定的提高。也另有研究将加热用于层析的后处理，即对离子交换层析样品进行加热处理，同样能够将HBc-VLP的纯度提高到87.5％。但是在这些研究中，通常通过一步加热预处理去除部分杂质，再经过后续的一步层析步骤，因此HBc-VLPs的纯度仍然相对较低。因此，如何进一步提升HBc-VLPs的纯度，对于HBc-VLPs的研究以及相关的下游研究具有重要的价值。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种纯化HBc-VLPs或HBc-VLPs衍生物的方法，以使得HBc-VLPs及其衍生物经过纯化后的纯度进一步提升，同时避免其他杂蛋白的污染。为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供了一种纯化HBc-VLPs或HBc-VLPs衍生物的方法，所述方法为：将含有HBc-VLPs的菌液或HBc-VLPs衍生物的菌液，依次经过第一次热处理和第二次热处理后，得到纯化的HBc-VLPs或纯化的HBc-VLPs衍生物。在本专利技术中，HBc-VLPs为乙肝核心抗原病毒样颗粒，HBc-VLPs为乙肝核心抗原病毒样颗粒的衍生物。本专利技术意外地发现，由于VLPs是由几十甚至几百个亚基自组装而成的具有空腔结构的纳米颗粒，在加热过程中，亚基与亚基之间容易发生结构变化，甚至在颗粒表面产生较大空隙，因此如果在较高温度下进行加热处理，较小分子量的杂蛋白会进入病毒样颗粒空腔内部，造成产品的污染。而本专利技术提供的纯化方法，通过二次梯度加热的方法，实现了快速纯化制备HBc-VLPs及HBc-VLPs衍生物；由于HBc-VLPs具有突出的热稳定性，首先加热处理后，沉淀除去热不稳定的宿主蛋白，同时最大限度的保证了目的蛋白的结构，而后进一步提升温度，进一步除去杂蛋白，为后续可选择地精制纯化降低了负担，同时避免了小分子量的杂蛋白在加热过程中进入颗粒的内部，造成产品污染的问题。相比于目前关于HBc-VLPs的纯化方法，纯度得到了较大提高。本专利技术提供的纯化方法降低了HBc-VLPs及HBc-VLPs衍生物的生产成本，在获得高纯度蛋白的前提下，节省了时间，提高了收率，收率可达到90％左右，并且可重复性好，稳定性高，适于工业规模化制备，具有较大的实际应用价值和工业推广前景。优选地，所述第一次的温度低于第二次热处理的温度。优选地，所述第一次热处理的温度为30℃～60℃，例如可以是30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃或60℃等。事实上，本专利技术通过实验验证，第一次热处理的温度应低于70℃，这是由于温度高于70℃时，杂质蛋白进入颗粒内部，进而发现，当热处理的温度在30℃～60℃之间时，能达到较好的处理效果。优选地，所述第一次热本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纯化HBc‑VLPs或HBc‑VLPs衍生物的方法，其特征在于，所述方法为：将含有HBc‑VLPs的菌液或HBc‑VLPs衍生物的菌液，依次经过第一次热处理和第二次热处理后，得到纯化的HBc‑VLPs或纯化的HBc‑VLPs衍生物。

【技术特征摘要】
1.一种纯化HBc-VLPs或HBc-VLPs衍生物的方法，其特征在于，所述方法为：将含有HBc-VLPs的菌液或HBc-VLPs衍生物的菌液，依次经过第一次热处理和第二次热处理后，得到纯化的HBc-VLPs或纯化的HBc-VLPs衍生物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一次的温度低于第二次热处理的温度。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第一次热处理的温度为30℃～60℃；优选地，所述第一次热处理的温度为45℃～60℃；优选地，所述第一次热处理的时间为10min～300min。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二次热处理的温度为65℃～90℃；优选地，所述第二次热处理的温度为70℃～80℃；优选地，所述第二次热处理的时间为10min～300min。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一次热处理和第二次热处理之间，还包括离心菌液，收集离心后的上清液的步骤；优选地，所述离心的离心力为5000g～30000g；优选地，所述离心的时间为10min～40min；优选地，所述离心时的温度为4℃～25℃。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二次热处理后，还包括进一步精制；优选地，所述精制的方法包括疏水层析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述纯化的HBc-VLPs的纯度大于95％；优选地，所述纯化的HBc-VLPs衍生物的纯度大于95％。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述HBc-VLPs的菌液由如下步骤制备得到：(1)PCR扩增表达全长的HBcAg的核苷酸序列，将扩增后的序列克隆至质粒pET21a中，获得重组质粒pET21a-HB...

【专利技术属性】
技术研发人员：张松平，苏志国，李正军，杨延丽，马光辉，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11