基于乙型肝炎核心抗原的疫苗制造技术

本发明专利技术提供一种包含乙型肝炎核心抗原（HBcAg）的蛋白，其具有在el环中的式XpZqXr的序列，其中X是带负电荷的氨基酸残基，Z是带正电荷的氨基酸残基，并且p、q和r每个都独立地为1至12的整数，并且其中糖被连接至Z残基。所述蛋白可以包含串联的HBcAg的第一拷贝和第二拷贝，其中HBcAg的一个或两个拷贝具有被连接至e1环的糖。第一拷贝可以具有连接至e1环的糖，第二拷贝可以包含e1环中的蛋白表位。所述蛋白可以被用来诱导针对所述糖的免疫响应并因此作为疫苗。

Hepatitis B vaccine based on hepatitis B core antigen

The present invention provides one kind of hepatitis B core antigen (HBcAg) protein, its sequence in the El ring in XpZqXr, where X is a negatively charged amino acid residues, Z is positively charged amino acid residues, and P, Q and r each independently as an integer from 1 to 12, and which is connected to the Z residue. The protein can contain the first copy and second copy of the series of HBcAg, in which one or two copies of HBcAg have sugar connected to the E1 ring. The first copy can have sugar connected to the E1 ring, and the second copy can contain the protein epitopes in the E1 ring. The protein can be used to induce immune response to the sugar and thus be used as a vaccine.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于乙型肝炎核心抗原的疫苗
本专利技术涉及包含具有连接至e1环的糖的乙型肝炎核心抗原（HBcAg）的蛋白、生产连接有糖的蛋白的方法、含有所述蛋白的药物组合物和所述蛋白在对象中诱导免疫响应的用途。
技术介绍
乙型肝炎（HepatitisB）病毒核心（HBc）蛋白具有某种程度上的独特结构，它由两个反平行的α螺旋组成，其形成特有的“穗（spike）”结构。然后两个HBc分子自发地二聚化形成双穗束。该双穗束是病毒样颗粒（VLP）的构成部件。VLP是具有吸引力的疫苗系统，因为它们的高度重复序列递送抗原的多个拷贝。进一步地，病毒核酸的缺乏使得它们成为特别安全的载体。HBc作为疫苗载体是特别有趣的，因为它具有几个可能让抗原序列插入的位点。然后HBc的极端免疫原性也赋予被插入的序列，因此使得其也具有过度的免疫原性。最佳的插入位点是主要插入区域（MIR）。然而，先前表明，当较大的或疏水性的序列被插入MIR时，则单体的HBc不能二聚化且VLP没有形成。这导致免疫原性的大量损失。目前没有可用于细菌生物威胁因子类鼻疽伯克霍尔德氏菌（Burkholderiapseudomallei）和鼻疽伯克霍尔德氏菌（Burkholderiamallei）的许可疫苗，它们分别为类鼻疽和鼻疽的致病因子。
技术实现思路
本专利技术涉及一种基于乙型肝炎（HBV）核心蛋白的疫苗递送系统。在递送之前，糖被连接至HBV核心蛋白，使得能够引起对糖类的免疫响应。因此本专利技术提供一种包含乙型肝炎核心抗原（HBcAg）的蛋白，其具有在el环中的式XpZqXr的序列，其中X是带负电荷的氨基酸残基，Z是带正电荷的氨基酸残基，并且p、q和r每个都独立地为1至12的整数，并且其中糖被连接至Z残基。所述蛋白可以包含串联的HBcAg的第一拷贝和第二拷贝，其中HBcAg的一个或两个拷贝具有被连接至e1环的糖。本专利技术还提供：-一种包含本专利技术的蛋白的多个拷贝的颗粒；-一种生产本专利技术的蛋白的方法，所述方法包括将一个或多个糖连接至e1环；-一种药物组合物，其包含本专利技术的蛋白或本专利技术的颗粒以及药学上可接受的载体或稀释剂；-用于在人体或动物体的疫苗接种方法中使用的本专利技术的蛋白或本专利技术的颗粒；-本专利技术的蛋白或本专利技术的颗粒用于制备用于人体或动物体的疫苗接种的药物的应用；以及-一种在对象中诱导免疫响应的方法，所述方法包括向所述对象施用本专利技术的蛋白或本专利技术的颗粒。附图说明图1：SDS-PAGE证实了串联核心在酵母裂解物的可溶性级分中被发现。提取粗裂解物（泳道3），在20,000xg下旋降（spun），提取上清液（泳道4）。颗粒（泳道5）中的任何物质都不可用。上清液被稀释（泳道6），然后通过0.8µm、0.45µm和0.2µm的三个过滤器（泳道7-9）。材料通过横流过滤器并保留滞留物（泳道10）。将其过滤，然后置于CL4B柱（泳道11）上。然后将空隙体积通过S1000柱（12泳道）。图2：从CL4B柱的空隙体积中分离VLP（（B）的左侧面板上的较大的峰）。泳道上方的数字是从CL4B柱收集的级分编号。图3：然后将CL4B空隙通过S1000柱，从级分12-15分离VLP。通过SDS-PAGE和免疫印迹（westernblot）确认纯度。数字是从第二S1000柱收集的串联核心阳性级分。图4：（A）使用银染色的SDS-PAGE证实，存在串联核心（标有*），但纯度低于同等的酵母制剂。（B）电子显微镜将主要污染物识别为杆状病毒病毒粒子本身。图5：泳道A：分子量标记物，泳道B：未修饰的VLP，泳道C：经修饰的VLP。图6：（A）蔗糖垫的示意图（未按比例）、（B）未结合的FITC和（C）FITC-VLP结合物。图7：泳道A：分子量标记物，泳道B：BSA（2mg/ml），泳道C：BSA（0.5mg/ml），泳道D：糖结合物（2mg/ml）和泳道E：糖结合物（0.5mg/ml）。图8：携带LolC插入物的VLP在ELISA中被测试，其使用感染了野生型伯克霍尔德氏菌的小鼠中产生的抗体。对应于VLPLolC的线对30ug/ml的值位于1.6和1.8平均OD之间。对应于空载VLP的线对30ug/ml的值位于0.4平均OD附近。图9：在电子显微镜下可视化的经结合的CPS。免疫金染色透射电子显微镜（TEM）。（A）Tris缓冲盐水（TBS）对照。（B）抗CPSmAb。图10：VLP-CPS结合物的效果。将BALB/c小鼠免疫接种3次，间隔两周并通过腹腔内途径用B.pseudomalleiK96243进行挑战。与使用（A）未结合的CPS相比，使用（B）VLP-CPS结合物疫苗实现了显著更好的保护。p=0.0001对数秩（LogRank）（Mantel-Cox)）检验，对挑战剂量进行了调整。MLD：最小致死剂量。图11：与使用未结合的CPS免疫接种的小鼠相比，在VLP-CPS结合物免疫接种的小鼠中，CPS特异性血清(A)IgG和(B)IgM滴度更高。序列简述SEQIDNO:1是ayw亚型的183个氨基酸的蛋白加上HBcAg的29个氨基酸的前序列以及相应的核苷酸序列。SEQIDNO:2是ayw亚型的183个氨基酸的蛋白加上HBcAg的29个氨基酸的前序列。SEQIDNO:3是HBcAg可以包含来平衡α-螺旋的序列。SEQIDNO:4是构建体CoHo7e的序列。SEQIDNO:5是构建体H3Ho的序列。SEQIDNO:6是空LolC构建体的序列。SEQIDNO:7是LolC-K6构建体的序列。SEQIDNO:8是LolC-K1构建体的序列。SEQIDNO:9是LolC的序列。SEQIDNO:10是包含D3-K6-D3序列的构建体的序列。专利技术详述此外，如在本说明书和在附属的权利要求书中使用的，除非另有明确说明，否则单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数引用。因此，例如，对“一个糖”的引用包括两个或更多个这样的糖，或者对“一个蛋白表位”的引用包括两个或更多个这样的蛋白表位。本文所引用的所有出版物、专利和专利申请，无论是在上文或下文中引用的，在此通过引用以其整体合并入本文中。乙型肝炎核心抗原（HBcAg）根据HBV的亚型，HBcAg具有183或185个氨基酸（aa）。ayw亚型的183个氨基酸的蛋白的序列加上29个氨基酸的前序列显示于SEQIDNO:2中。成熟的HBcAg为第30位的Met残基至最C末端的Cys残基，第1至29位的序列是前序列。所述蛋白可以包括形成二聚体的HBcAg的两个拷贝。HBcAg的二聚体形成VLP的结构性构成部件。该HBcAg单元通常以头至尾的形式连接在一起，即一个单元的C末端连接至相邻单元的N末端。这些单元可通过共价键（例如肽键）直接连接，但优选地它们通过接头连接，所述接头将相邻的单元隔开，从而避免破坏相邻单元的包装的问题。接头的性质在下文讨论。所述蛋白中的HBcAg可以是天然的全长HBcAg。所述HBcAg具有连接至e1环的糖。具有式XpZqXr的序列被插入el环中，使得一个或多个糖可以被随后连接至一个或多个带正电荷的残基。X是带负电荷的氨基酸残基，Z是带正电荷的氨基酸残基并且p、q和r每个都独立地为1至12的整数。在所述蛋白包含串联的HBcAg的第一拷贝和第二拷贝的情况中，HBcAg的一个拷贝具有连接至e本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白，其包括具有在el环中的式XpZqXr的序列的乙型肝炎核心抗原（HBcAg），其中X是带负电荷的氨基酸残基，Z是带正电荷的氨基酸残基，并且p、q和r每个都独立地为1至12的整数，并且其中糖被连接至Z残基。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.25 GB 1505041.21.一种蛋白，其包括具有在el环中的式XpZqXr的序列的乙型肝炎核心抗原（HBcAg），其中X是带负电荷的氨基酸残基，Z是带正电荷的氨基酸残基，并且p、q和r每个都独立地为1至12的整数，并且其中糖被连接至Z残基。2.一种蛋白，其包括串联的HBcAg的第一拷贝和第二拷贝，其中HBcAg的一个或两个拷贝具有在el环中的如在权利要求1中定义的式XpZqXr的序列以及被连接至Z残基的糖。3.根据权利要求2所述的蛋白，其中HBcAg的所述第一拷贝具有在el环中的如在权利要求1中定义的式XpZqXr的序列以及被连接至Z残基的糖，并且所述第二拷贝包括在所述el环中的蛋白表位。4.根据前述权利要求的任一项所述的蛋白，其中Z是赖氨酸或精氨酸。5.根据前述权利要求的任一项所述的蛋白，其中X是天冬氨酸或谷氨酸。6.根据前述权利要求的任一项所述的蛋白，其中Z是赖氨酸，X是天冬氨酸。7.根据前述权利要求的任一项所述的蛋白，其中p、q和r每个都独立地为1至6的整数。8.根据前述权利要求的任一项所述的蛋白，其中p加r的总和等于q。9.根据前述权利要求的任一项所述的蛋白，其中p是3，q是6，r是3。10.根据前述权利要求的任一项所述的蛋白，其中X是天冬氨酸，Z是赖氨酸，p是3，q是6，r是3。11.根据前述权利要求的任一项所述的蛋白，其中式XpZqXr的序列侧翼有多个丙氨酸。12.根据前述权利要求的任一项所述的蛋白，其中一个或多个所述糖衍生自细菌。13.根据权利要求12所述的蛋白，其中所述细菌是伯克霍尔德氏菌（Burkholderia）。14.根据权利要求13所述的蛋白，其中所述细菌是类鼻疽伯克霍尔德氏菌（Burkholderiapseudomallei）或鼻疽伯克霍尔德氏菌（Burkholderiamallei）。15.根据前述权利要求的任一项所述的蛋白，其中一个或多个所述糖包括常见的荚膜多糖（CPS）。16.根据前述权利要求的任一项所述的蛋白，其中一个或多个所述糖包括1-3个连接的2-O-乙酰基-6-脱氧-β-D-甘露-庚吡喃糖的无支链的均聚物。17.根据权利要求3至16的任一项所述的蛋白，其中所述蛋白表位来自伯克霍尔德氏菌（Bur...

【专利技术属性】
技术研发人员：迈克尔·安东尼·惠兰，罗伯特A·菲尔德，大卫J·罗兰兹，
申请(专利权)人：IQUR有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB