一种HBcAg-VLP或HBcAg-VLP衍生物的纯化方法技术

本发明专利技术提供了一种HBcAg‑VLP或HBcAg‑VLP衍生物的纯化方法，所述方法包括如下步骤：将含有HBcAg‑VLP的上样液或HBcAg‑VLP衍生物的上样液使用疏水作用层析填料处理得到纯化的HBcAg‑VLP或纯化的HBcAg‑VLP衍生物；本发明专利技术所提供的纯化方法，克服了步骤繁多、收率较低、耗材昂贵等现有方法存在的问题，仅需要一步疏水层析即可实现纯化，在不使用凝胶过滤的精制方法处理时，收率最高可达到90％以上，纯度最高可达到86％左右，大大提升了纯化效果，如果辅以进一步的凝胶过滤等精制纯化的方法，其纯度可达到99％以上，具有良好的应用前景和非常高的应用价值。

Purification of HBcAg-VLP or HBcAg-VLP Derivatives

The present invention provides a purification method of HBcAg VLP or HBcAg VLP derivatives. The method comprises the following steps: purifying the sample solution containing HBcAg VLP or the sample solution containing HBcAg VLP derivatives by using hydrophobic interaction chromatography filler to obtain the purified HBcAg VLP or the purified HBcAg VLP derivatives; The purification method provided by the present invention overcomes many steps, low yield and low yield. The problems of existing methods such as expensive materials can be purified only by one-step hydrophobic chromatography. The highest yield can reach more than 90% without the use of gel filtration. The highest purity can reach about 86%, which greatly improves the purification effect. If combined with a step by step gel filtration method, its purity can reach more than 99%, and its purity is good. Good application prospects and very high application value.

【技术实现步骤摘要】
一种HBcAg-VLP或HBcAg-VLP衍生物的纯化方法
本专利技术属于生化分离领域，涉及一种HBcAg-VLP或HBcAg-VLP衍生物的纯化方法，尤其涉及一种HBcAg-VLP或HBcAg-VLP衍生物的疏水层析纯化方法。
技术介绍
乙型肝炎病毒核心抗原(HepatitisBviruscoreantigen，HBcAg)是乙肝病毒的衣壳蛋白。乙肝核心抗原病毒样颗粒(HBcAg-VLP)是由180个或240个核心蛋白亚基自组装构成，呈正二十面体对称的颗粒结构。HBcAg-VLP不仅自身具有很强的免疫原性，而且可以作为疫苗载体，在其C端、N端以及免疫原区(MIR)均可以插入外源片段而不影响其组装的正确性。HBcAg-VLP为载体的疫苗如口蹄疫疫苗、疟疾疫苗等均取得了良好的效果，另外，HBcAg-VLP由于具有空壳结构，也可以用来包裹核酸以及其他的小分子物质。HBcAg-VLP作为一种研究广泛的病毒样颗粒，一直被视作分析展示外来肽链的最灵活也是最有希望的模型。纯化技术在其研究与应用进程中发挥着至关重要的作用。通常认为，纯化过程占据了生物产品整个过程70％的成本，病毒样颗粒为基础的疫苗，往往是多个亚基自组装而成的多聚体结构，因此与其他种类的疫苗纯化相比，纯化过程不仅要去除宿主蛋白、宿主DNA、内毒素等杂质，还需要去除未正确组装的病毒样颗粒，这就为病毒样颗粒的纯化带来了新的挑战。HBcAg-VLP传统的纯化方法主要包括加热预处理，硫酸铵沉淀，超滤除杂，PEG沉淀等，但是这些方法难以获得高纯度的乙肝核心抗原病毒样颗粒。密度梯度离心是目前实验室制备HBcAg-VLP采用较多的方法，采用梯度离心，不仅可以达到较高的纯度，而且可以保持颗粒的结构与免疫原性，但是梯度离心处理量有限，同时操作成本也比较高，难以应用于工业规模化生产。色谱技术具有分离效率高，应用范围广，易于放大等优点，其已经成功应用于病毒样颗粒(VLPs)的纯化。目前，基于色谱技术的HBcAg-VLP分离纯化中，大多集中在单个的过程单元研究，却没有形成从头到尾的完整纯化工艺。目前，虽然发展了一种完整的HBcAg-VLP的纯化工艺(Expression,purificationandcharacterizationoffull-lengthRNA-freehepatitisBcoreparticles,ProteinExpressionandPurification,54(2007)30-37)，但其涉及离子交换层析，凝胶过滤层析以及亲和层析，步骤繁多，收率很低，不足10％。另外，在过程单元的研究中，也主要是针对离子交换的研究，包括利用离子填料的扩张床吸附HBcAg-VLPs(DirectpurificationofrecombinanthepatitisBcoreantigenfromtwodifferentpre-conditionedunclarifiedEscherichiacolifeedstocksviaexpandedbedadsorptionchromatography,JournalofChromatographyA,1172(2007)47-56)，利用离子交换穿透式层析除去体系中的杂蛋白达到分离HBcAg-VLPs的目的(NegativechromatographypurificationofhepatitisBvirus-likeparticlesusingpoly(oligo(ethyleneglycol)methacrylate)graftedcationicadsorbent,JournalofChromatographyA,1415(2015)161-165；NegativechromatographyofhepatitisBvirus-likeparticle:Comparativestudyofdifferentadsorbentdesigns,JournalofChromatographyA,1445(2016)1-9)等，离子交换填料由于其配基与颗粒之间存在较强的相互作用力，可能导致大颗粒结构的破坏而产生巨大的损失。另外，CN102199217B公开了采用Ni2+亲和层析纯化方法来纯化乙型肝炎病毒多表位融合蛋白及其制备方法与应用，该融合蛋白是在乙型肝炎病毒核心蛋白的第78-79位氨基酸之间插入由HBsAg313-321、HBsAg335-343、Pol150-159、Pol455-463和Padre表位通过连接肽串联而成的乙型肝炎病毒多表位融合肽而得到；其制备方法是先构建乙型肝炎病毒多表位融合蛋白表达质粒pET28-HBcAg-HP，再用大肠杆菌表达系统进行IPTG诱导表达，最后用亲和层析纯化即得。但是亲和色谱的载体一般较为昂贵，机械强度不够高，因此不能耐受高压，而且在洗脱的过程中，配基会发生脱落并进入分离体系，给纯化造成额外的负担。CN108047316A公开了一种重组乙肝核心抗原的分离纯化方法，该方法包含热变性澄清、硫酸铵沉淀、超滤浓缩和洗滤换液、解聚合、第一步分子筛层析、超滤浓缩、洗滤和换液、复聚和第二步分子筛层析等步骤。该方法可获得的高纯度、低宿主残留、颗粒结构均一、高度稳定的重组乙肝核心抗原。但是，此方法步骤过于繁琐，经济价值较低，不利于大规模制备。因此，目前关于HBcAg-VLP的纯化方法仍然是限制其应用的瓶颈问题，如何发展一种规模化制备HBcAg-VLP的技术是当务之急，对于拓展其应用具有重要的意义。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种HBcAg-VLP或HBcAg-VLP衍生物的纯化方法，使得能够提升HBcAg-VLP或者其衍生物的纯化效率，纯化效果，降低生产成本，进一步达到规模化制备的目的。为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供了一种HBcAg-VLP或HBcAg-VLP衍生物的纯化方法，所述方法包括如下步骤：将含有HBcAg-VLP的上样液或HBcAg-VLP衍生物的上样液使用疏水作用层析填料处理得到纯化的HBcAg-VLP或纯化的HBcAg-VLP衍生物。本专利技术提供的纯化方法，从HBcAg-VLP(乙肝核心抗原病毒样颗粒)的结构分析着手，首先HBcAg-VLP亚基与亚基之间存在多对二硫键，稳定性好，可以耐受高温、高盐等极端条件，另外发现在颗粒表面存在大量的疏水性氨基酸，形成疏水性口袋，因此可充分利用HBcAg-VLP稳定性好以及疏水性强的特性，采用疏水层析，保证HBcAg-VLP完整颗粒结构的前提下，将HBcAg-VLP以及其衍生物吸附在层析柱或层析填料上，与其他杂质进行分离，达到提纯制备的目的。相比于目前采用离子交换层析法存在的收率低，纯度较低的问题，本专利技术的纯化方法在不使用凝胶过滤的精制方法处理时，收率最高可达到90％以上，纯度最高可达到86％左右，大大提升了纯化效果，如果辅以进一步的凝胶过滤等精制纯化的方法，其纯度可达到99％以上。本专利技术提供的纯化方法操作步骤少，仅仅需要一步疏水层析即可实现纯化；时间短，收率高，工艺稳定，重复性好，易于放大与工业化规模生产，具有较大的实际应用价值和推广前景。优选地，所述HBcAg-VLP的菌液由以下步骤制备得到：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种HBcAg‑VLP或HBcAg‑VLP衍生物的纯化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将含有HBcAg‑VLP的上样液或HBcAg‑VLP衍生物的上样液使用疏水作用层析填料处理得到纯化的HBcAg‑VLP或纯化的HBcAg‑VLP衍生物。

【技术特征摘要】
1.一种HBcAg-VLP或HBcAg-VLP衍生物的纯化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将含有HBcAg-VLP的上样液或HBcAg-VLP衍生物的上样液使用疏水作用层析填料处理得到纯化的HBcAg-VLP或纯化的HBcAg-VLP衍生物。2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述HBcAg-VLP的菌液由以下步骤制备得到：(1)PCR扩增表达全长的HBcAg的核苷酸序列，将扩增后的序列克隆至质粒pET21a中，获得重组质粒pET21a-HBcAg；(2)将重组质粒pET21a-HBcAg转入大肠杆菌表达系统，使用IPTG诱导表达后，破碎菌体，收集上清液得到所述HBcAg-VLP的上样液；优选地，所述HBcAg-VLP衍生物的菌液由以下步骤制备得到：(a)PCR扩增表达全长的HBcAg的核苷酸序列，将扩增后的序列克隆至质粒pET21a中，而后将目的蛋白的核苷酸序列插入到HBcAg的核苷酸序列中，获得重组质粒pET21a-HBcAg衍生物；(b)将重组质粒pET21a-HBcAg衍生物转入大肠杆菌表达系统，使用IPTG诱导表达后，破碎菌体，收集上清液得到所述HBcAg-VLP衍生物的上样液。3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中所述HBcAg的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。4.根据权利要求2或3所述的纯化方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(b)中转入大肠杆菌表达系统的方法均为热转化法或电转化法；优选地，步骤(2)和步骤(b)中所述IPTG的浓度均各自独立地为0.1mmol/L～1mmol/L；优选地，步骤(2)和步骤(b)中所述破碎菌体的缓冲溶液为醋酸缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：张松平，马小伟，苏志国，安文琪，李正军，杨延丽，张静静，马光辉，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，华兰生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11