【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，涉及sirpα阻断剂多肽、其构建方法及在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术介绍
1、巨噬细胞作为免疫系统的重要组成部分，可以吞噬和清除入侵的微生物，但同样可以清除注射的药物，纳米粒子和病毒载体，这便会极大缩短治疗剂和显像剂在体内的滞留时间从而降低病灶位点的富集。目前通过聚乙二醇、脂质体、聚合物和蛋白质包覆药物形成纳米颗来延缓免疫系统的清除，但形成的包封结构则会阻碍病灶位点细胞的吞噬显著降低药效。
2、整合素相关蛋白(cluster ofdifferentiation 47，cd47)是一种跨膜免疫球蛋白，在多种癌细胞表面过度表达，通过与巨噬细胞表面表达信号调节蛋白(signalregulatory proteinα，sirpα)的n末端结合，活酪氨酸磷酸化酶抑制肌球蛋白在巨噬细胞突触膜下装配位点的聚集，发出“别吃我”的信号，抑制巨噬细胞的吞噬作用，从而保护健康细胞不被免疫系统破坏，也使得癌细胞能够逃避巨噬细胞介导的吞噬作用。cd47蛋白与凋亡、增殖、黏附、迁移等细胞学过程密切相关，在免疫及心血管反应中扮演关键角色，同时参与了肿瘤免疫逃逸，对肿瘤细胞的微环境有重要影响。
3、基于cd47和sirpα免疫检查点抑制剂的研究已经成为目前免疫治疗的热点，通过开发cd47或sirpα的抗体或小分子药物阻断cd47和sirpα的信号传导，从而激活巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬达到癌症治疗的目的。研究表明，cd47和sirpα通过1:1的形式发生相互交叉高度卷曲的结合，结合位点均发生在cd47和sirpα
技术实现思路
1、本专利技术的第一目的在于提供一种sirpα阻断剂多肽及构建方法；第二目的在于提供上述sirpα阻断剂多肽白蛋白修饰中的作用，提供了一种血清白蛋白载体，通过抑制巨噬细胞吞噬增加稳定性。所述多肽在药物载体的研发中具有广阔的应用前景。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用的具体技术方案如下：
3、本专利技术的第一方面提供了一种sirpα阻断剂多肽，用于阻断cd47和sirpα间免疫结合，为氨基酸序列evteltrege(seq id no.1)，或包含该氨基酸序列的可溶肽或者其功能保守性变体。
4、上述所述的sirpα阻断剂多肽的结构通式如下式i所示：
5、
6、其中，x选自c、o、n中的任意一种，
7、y选自oh、间隔基、小分子药物、荧光染料、多肽、核酸和蛋白质中的一种或多种，被衍生成盐，酯，酰胺或酰肼，
8、a选自h或c＝o，
9、b选自h、间隔基、小分子药物、荧光染料、多肽、核酸和蛋白质中的一种或多种，被衍生成胺盐酸盐、对甲苯磺基、苄氧羰基、叔丁羰基、氯乙酰或甲酰基盐。
10、c选自h，间隔基、小分子药物、荧光染料，多肽、核酸和蛋白质中的一种或多种，被衍生成o-酰基或o-烷基衍生物。
11、优选的，所述间隔基选自饱和烷基链(碳个数为4-10)，聚乙二醇(聚合度为2-6)中的任意一种或多种；小分子药物选自紫杉醇、喜树碱、二氢卟吩e6中的任意一种或多种；荧光染料选自吲哚菁绿、二氢卟吩e6、新吲哚菁绿ir800中的任意一种或多种；所述多肽为靶向多肽，用于抗肿瘤治疗，如靶向cpc-3的多肽；所述蛋白质为血清白蛋白，选自人血清白蛋白、重组人血清白蛋白、牛血清白蛋白、猪血清白蛋白、驴血清白蛋白中的任意一种。
12、本专利技术的具体实施方式中，提供了sirpα阻断剂多肽em-17，其氨基酸序列如下所示：maleimide-ggggggevteltrege(seq id no.2)所示，结构式如下式ii所示：
13、
14、本专利技术的第二方面，提供了sirpα阻断剂多肽(seq id no.1所示的氨基酸序列的功能保守性变体ee-10)的制备方法，包括如下步骤：
15、步骤1，以9-芴基甲氧基羰基-谷氨酸-氧叔丁基为原料，cl树脂为载体，加缩合剂苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐以摩尔比1:1:3进行偶联30min，形成9-芴基甲氧基羰基谷氨酸树脂；
16、步骤2，采用体积比为1:5的哌啶及n,n-二甲基甲酰胺脱除9-芴基甲氧基羰基保护反应15min，并采用二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺洗涤后，分别加入c端第二个保护氨基酸9-芴基甲氧基羰基-甘氨酸-氧叔丁基、缩合剂苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐、n,n-二异丙基乙胺以摩尔比1:3:1进行偶联；二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺洗涤后，用体积比为1:5的哌啶和n,n-二甲基甲酰胺脱除9-芴基甲氧基羰基保护；后续经过洗涤-偶联-再洗涤的步骤，直至最后一个氨基酸偶联结束，形成全保护多肽树脂；
17、步骤3，以体积比为82.5:5:5:2.5:5的三氟乙酸、苯甲硫醚、苯酚、乙二硫醇、水混合液作为切肽试剂，将多肽从载体树脂上裂解下来，并同时脱去所有保护剂，2h后加入4℃预冷的乙醚使多肽沉淀，离心收集沉淀物，并用乙醚洗涤多次后，真空抽干，得到多肽粗品。
18、进一步，包含ee-10的功能保守性变体多肽em17的制备方法，包括如下步骤：
19、步骤1，称取9-芴基甲氧基羰基-谷氨酸-氧叔丁基树脂，经二氯甲烷溶胀并减压抽掉二氯甲烷；用n,n-二甲基甲酰胺洗涤树脂3遍，加入20％哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液反应20分钟，除去9-芴基甲氧基羰基保护基，减压抽掉溶液，用n,n-二甲基甲酰胺洗涤6遍；
20、步骤2，称取第二个氨基酸9-芴基甲氧基羰基-甘氨酸-氧叔丁基加入到树脂中，n,n-二甲基甲酰胺溶解并加入n,n-二异丙基乙胺反应30分钟，反应完全后减压抽掉溶剂；重复该步骤2，直至接到最后一个原料6-马来酰亚胺己酸，然后用n,n-二甲基甲酰胺，二氯甲烷，甲醇各洗三遍，抽干树脂；
21、步骤3，以体积比为82.5:5:5:2.5:5的三氟乙酸、苯甲硫醚、苯酚、乙二硫醇、水混合液作为切肽试剂，将多肽从载体树脂上裂解下来，并同时脱去所有保护剂，一定时间后，加入4℃预冷的乙醚使多肽沉淀，离心收集沉淀物，并用乙醚洗涤多次后，真空抽干，得到多肽粗品。
22、实验显示，em17能够与血清蛋白偶联形成hsa-em17载体，其上可包载小分子光敏剂ce6，形成的hsa-em17-ce6在670nm处有明显的荧光，并可抑制巨噬细胞的吞噬，具有一定的药物载体价值。
23、优选的，本专利技术的第三方面，提供了一种血清白蛋白载体，其特征在于，包括血清白蛋白以及偶联在其上的sirpα阻断剂多肽，所述sirpα阻断剂多肽由权利要本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种SIRPα阻断剂多肽，其特征在于，阻断CD47和SIRPα间免疫结合，为SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，或包含该氨基酸序列的可溶肽或者其功能保守性变体。
2.根据权利要求1所述的SIRPα阻断剂多肽，其特征在于，该阻断剂多肽的结构通式如下式I所示：
3.根据权利要求1所述的SIRPα阻断剂多肽，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的SIRPα阻断剂多肽，其特征在于，该阻断剂多肽为多肽EM-17，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，结构式如下式II所示：
5.权利要求1所述的SIRPα阻断剂多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.权利要求5所述的SIRPα阻断剂多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.权利要求4所述的SIRPα阻断剂多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
8.一种药物载体，其特征在于，包括载体以及偶联在其上的SIRPα阻断剂多肽，所述SIRPα阻断剂多肽由权利要求1或4所示，所述载体选自血清白蛋白、聚乙二醇、脂质体及聚合物中的任意一种。
...【技术特征摘要】
1.一种sirpα阻断剂多肽，其特征在于，阻断cd47和sirpα间免疫结合，为seq id no.1所示氨基酸序列，或包含该氨基酸序列的可溶肽或者其功能保守性变体。
2.根据权利要求1所述的sirpα阻断剂多肽，其特征在于，该阻断剂多肽的结构通式如下式i所示：
3.根据权利要求1所述的sirpα阻断剂多肽，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的sirpα阻断剂多肽，其特征在于，该阻断剂多肽为多肽em-17，其氨基酸序列如seq id no.2所示，结构式如下式ii所示：
5.权利要求1所述的sirpα阻断剂多肽的制备方法，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：王红阳，贺晓鹏，豆伟涛，谈冶雄，董立巍，潘宇飞，田禾，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：
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