一种使用冷冻干燥的饲养层细胞制备NK的方法技术

本发明专利技术提供了一种使用冷冻干燥的饲养层细胞制备NK的方法，本发明专利技术的制备NK方法中构建表达细胞因子及膜蛋白的工程细胞，该表达细胞因子及膜蛋白的工程细胞经过冷冻干燥。本发明专利技术将饲养层细胞冷冻干燥后既保留了工程细胞作为饲养层细胞的刺激作用，又降低了细胞在灭活及保存过程中的成本，降低了实验室及临床使用中的成本并提高了其可使用的便利性。与现有的使用饲养层技术相比，在12～21天的时间获得可满足临床治疗数量的NK细胞，细胞活力高，对K562及A549都有较高的杀伤效果；相比因子法及专用的NK培养基方法，本发明专利技术在增殖倍数及数量上都有明显的优势；而干细胞诱导分化成NK后扩增获得的细胞数量及纯度都较本发明专利技术差。

【技术实现步骤摘要】
一种使用冷冻干燥的饲养层细胞制备NK的方法
本专利技术属于生物医药领域，特别涉及NK细胞培养技术。
技术介绍
自然杀伤细胞(naturalkillercell，NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别靶细胞、杀伤介质。现有的NK扩增培养技术大致分为四种：1.因子法：抽取外周血或利用单细胞采集机并结合淋巴细胞分离液获得PBMC(外周血单个核细胞)，然后直接培养或分选PBMC中NK细胞，在普通的淋巴细胞培养基中单独使用细胞因子或联合饲养层细胞扩增NK。2.抗体包被法：PBMC或分选后的NK细胞在抗体包被的培养瓶中用普通淋巴细胞培养基扩增培养。3.专用NK培养基：购买专用的NK培养基从PBMC中特异性扩增NK细胞或者对分选后的NK细胞进行扩增。4.干细胞诱导：将干细胞诱导分化成NK细胞然后进行扩增。因子法及抗体包被法(公开号：CN105238754B)在不使用饲养层细胞时在NK扩增数量、纯度及NK细胞活力上都难以满足临床需求，而传统方案使用的饲养层需要使用丝裂霉素或辐照灭活且灭活后需要在液氮中保存，增加了饲养层的使用成本，也不利于饲养层的商品化，而丝裂霉素的轻微残留可能会使NK在后续使用尤其是临床使用中对人体有不良的影响；另外如果先从PBMC中分选NK(公开号：CN103620022B)，又增加了操作步骤及成本，且培养体系中可能增加分选中异源成分而带来安全风险。专用的NK培养基(公开号：CN104894065B)虽然简化了NK扩增的步骤，但在NK扩增纯度及效率方面较传统方法优势并不明显，且专用NK培养基的成本较高。干细胞诱导分化成NK的方法(公开号:CN101801374B；公开号：CN104711225B)在干细胞来源获取及分化诱导过程中都有潜在的安全风险，且扩增效率不高。
技术实现思路
本专利技术提供一种使用冷冻干燥的饲养层细胞制备NK的方法、一种饲养层细胞制备方法以及一种饲养层细胞及其用途。本专利技术技术通过冷冻干燥的方式处理制备的表达特定产物的K562饲养层细胞得到操作简易成本低且安全的NK扩增方法。本专利技术其中一方面提供了一种使用冷冻干燥的饲养层细胞制备NK的方法，该方法中构建表达细胞因子及膜蛋白的工程细胞，上述表达细胞因子及膜蛋白的工程细胞经过冷冻干燥。本专利技术其中一方面提供了一种使用冷冻干燥的饲养层细胞制备NK的方法，其中细胞因子及膜蛋白为CD8α-白介素21、CD19、CD137L、CD86、或CD64中任意种组合。本专利技术其中一方面提供了一种使用冷冻干燥的饲养层细胞制备NK的方法，构建表达细胞因子及膜蛋白的工程细胞使用慢病毒转染系统，构建工程的细胞种类为K562细胞。上述构建表达细胞因子及膜蛋白的工程细胞种合成了五中基因，分别对应：CD64序列如SEQIDNo.1、CD86序列如SEQIDNo.2、CD137L序列如SEQIDNo.3、截短的CD19序列如SEQIDNo.4和膜锚定蛋白IL21序列如SEQIDNo.5。使用了引导肽序列如SEQIDNo.6，跨膜区序列如SEQIDNo.7。本专利技术其中一方面提供了一种使用冷冻干燥的饲养层细胞制备NK的方法，方法使用表达细胞因子及膜蛋白的工程细胞作为饲养层细胞。本专利技术其中一方面提供了一种使用冷冻干燥的饲养层细胞制备NK的方法，工程菌表达的表达细胞因子及膜蛋白为CD8α-白介素21、CD19、CD137L、CD86、和CD64。本专利技术其中一方面提供了一种使用冷冻干燥的饲养层细胞制备NK的方法，该方法步骤为：步骤一、使用慢病毒转染系统将CD8α-白介素21、CD19、CD137L、CD86、和CD64等五种细胞因子及膜蛋白构建到K562细胞上；步骤二、筛选步骤一所得细胞获得高纯度的同时表达五种因子及膜蛋白的K562工程细胞；步骤三、使用含有热灭活的10％FBS的RPMI1640扩增K562工程细胞；步骤四、离心收集步骤三的K562工程细胞，用细胞冻存液冻存液重悬，调整细胞密度至1×106～5×107个/ml，离心管分装适当体积混匀立即置于-80℃冷冻过夜，使细胞均匀分布于冻存液中；步骤五、从-80℃取出放置冷冻过夜的K562工程细胞，打开离心管管盖，置于预冷的冷冻干燥机中冷冻干燥至冻存液完全蒸发，-20℃到-80℃保存待用；使用时，取出保存的冷冻干燥K562细胞，使用培养液重悬并吹打混匀细胞，离心洗涤1-3次后培养液重悬并计数后使用。步骤六、淋巴细胞分离液分离PBMC，洗涤2-4次后培养液重悬后计数，调整细胞密度至0.3～2×106。步骤七、按PBMC:K562比例在1:1至10:1之间混合培养，调整PBMC密度至0.2至2×106个/ml，培养液为GT-T551-H3，加入IL2浓度为100～1000U/ml，血清(灭活)比例为5％～20％。步骤八、视细胞增殖状况在第四到六天补加含有IL2浓度为100～1000U/ml的新鲜培养液，分瓶并扩大培养体积，.后续培养补充含浓度为100～1000U/ml的IL2新鲜培养液并逐渐降低血清比例。步骤九、在第12～21天收集细胞并检测相关指标，获得纯度90％以上且细胞总数增殖倍数在100倍以上(NK细胞增殖1000倍)的NK细胞。本专利技术其中一方面提供了一种使用冷冻干燥的饲养层细胞制备NK的方法，细胞冻存液为serum-freehighefficientstemcellCryspreservationMidia,步骤六细胞密度为1×106个/ml，所述步骤七中血清为GT-T551-H3的10％，所述PBMC:K562比例为7:1。本专利技术其中一方面提供了一种使用冷冻干燥的饲养层细胞制备NK的方法，血清为自体血清、人AB血清或胎牛血清。本专利技术其中一方面还提供了一种饲养层细胞制备方法，制备方法使用慢病毒转染系统将CD8α-白介素21、CD19、CD137L、CD86、和CD64等五种细胞因子及膜蛋白构建到K562细胞上；然后经过筛选获得高纯度的同时表达五种因子及膜蛋白的K562工程细胞。本专利技术其中一方面还提供了一种饲养层细胞制备方法，上述制备方法合成了五种基因，分别对应：CD64序列如SEQIDNo.1；CD86序列如SEQIDNo.2；CD137L序列如SEQIDNo.3，截短的CD19序列如SEQIDNo.4和膜锚定蛋白IL21序列如SEQIDNo.5；使用了引导肽序列如SEQIDNo.6，跨膜区序列如SEQIDNo.7。本专利技术其中一方面还提供了一种K562工程细胞的用途，上述饲养层细胞制备方法制备的K562工程细胞用于NK细胞培养中。本专利技术其中一种技术方案制备NK的方法如下：(1)使用慢病毒转染系统将CD8α-白介素21、CD19、CD137L、CD86、和CD64等五种细胞因子及膜蛋白构建到K562细胞上；(2)经过筛选获得高纯度的同时表达五种因子及膜蛋白的K562工程细胞；(3)使用含有热灭活的10％FBS的RPMI1640扩增K562工程细胞；(4)离心收集K562工程细胞，用serum-freehighefficientstemcellCryspreservationMidia细胞冻存液重悬，调整细胞密度至1×106～5×10本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种使用冷冻干燥的饲养层细胞制备NK的方法，其特征在于，所述方法中构建表达细胞因子及膜蛋白的工程细胞，所述表达细胞因子及膜蛋白的工程细胞经过冷冻干燥。

【技术特征摘要】
1.一种使用冷冻干燥的饲养层细胞制备NK的方法，其特征在于，所述方法中构建表达细胞因子及膜蛋白的工程细胞，所述表达细胞因子及膜蛋白的工程细胞经过冷冻干燥。2.根据权利要求1所述的一种使用冷冻干燥的饲养层细胞制备NK的方法，其特征在于，所述细胞因子及膜蛋白为CD8α-白介素21、CD19、CD137L、CD86、或CD64中任意种组合。3.根据权利要求1所述的一种使用冷冻干燥的饲养层细胞制备NK的方法，其特征在于，所述构建表达细胞因子及膜蛋白的工程细胞使用慢病毒转染系统，所述构建工程的细胞种类为K562细胞；所述构建表达细胞因子及膜蛋白的工程细胞中合成了五种基因，分别对应：CD64序列如SEQIDNo.1、CD86序列如SEQIDNo.2、CD137L序列如SEQIDNo.3、截短的CD19序列如SEQIDNo.4和膜锚定蛋白IL21序列如SEQIDNo.5；使用了引导肽序列如SEQIDNo.6，跨膜区序列如SEQIDNo.7。4.根据权利要求3所述的一种使用冷冻干燥的饲养层细胞制备NK的方法，其特征在于，所述方法使用表达细胞因子及膜蛋白的工程细胞作为饲养层细胞。5.根据权利要求4所述的一种使用冷冻干燥的饲养层细胞制备NK的方法，其特征在于，所述工程菌表达的表达细胞因子及膜蛋白为CD8α-白介素21、CD19、CD137L、CD86、和CD64。6.根据权利要求1所述的一种使用冷冻干燥的饲养层细胞制备NK的方法，其特征在于，所述方法步骤为：步骤一、使用慢病毒转染系统将CD8α-白介素21、CD19、CD137L、CD86、和CD64等五种细胞因子及膜蛋白构建到K562细胞上；步骤二、筛选所述步骤一所得细胞获得高纯度的同时表达五种因子及膜蛋白的K562工程细胞；步骤三、使用含有热灭活的10％FBS的RPMI1640扩增K562工程细胞；步骤四、离心收集步骤三的K562工程细胞，用细胞冻存液冻存液重悬，调整细胞密度至1×106～5×107个/ml，离心管分装适当体积混匀立即置于-80℃冷冻过夜，使细胞均匀分布于冻存液中；步骤五、从-80℃取出放置冷冻过夜的K562工程细胞，打开离心管管盖，置于预冷的冷冻干燥机中冷冻干燥至冻存液完...

【专利技术属性】
技术研发人员：李彦涛，杨娟，吴卫成，郝瑞栋，刘根桃，吴国祥，
申请(专利权)人：上海科医联创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31