一种灭活饲养细胞联合细胞因子刺激NK细胞扩增的方法技术

本发明专利技术的目的是提供一种新型灭活重组K562细胞联合细胞因子组合刺激NK细胞扩增的方法。本发明专利技术制备得到的NK细胞，具有很高的纯度和杀伤活性，经检测培养至14天时，NK细胞纯度达90％以上；当效靶比为10:1时，NK细胞对K562细胞的杀伤活性为80％以上。本发明专利技术制备的NK细胞增殖速度快，培养至14‑17天细胞扩增倍数达500以上，本发明专利技术制备的NK细胞有很好的靶向杀伤肿瘤细胞的效果。

【技术实现步骤摘要】
一种灭活饲养细胞联合细胞因子刺激NK细胞扩增的方法
本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种灭活饲养细胞联合细胞因子刺激NK细胞(Naturalkillercells)扩增的方法。
技术介绍
目前，癌症已经成为全球第一死亡原因。常规治疗癌症的手段有：手术、放疗和化疗三种方式。免疫细胞治疗是继手术、化疗和放疗之后的第四大治疗肿瘤的新方式，其能系统杀灭肿瘤细胞，有效抑制肿瘤细胞的转移，副反应小，临床效果好。免疫细胞治疗应用于临床的有DC细胞、CIK细胞、DC-CIK细胞和NK细胞。NK细胞是第三类淋巴细胞，不同于T/B淋巴细胞，无需抗原刺激即可发挥细胞毒效应，能自发溶解多种肿瘤细胞和被病毒感染的细胞，还可以分泌多种细胞因子和趋化因子参与免疫调节。NK细胞的免疫治疗在抗病毒，抗肿瘤的治疗中有着广泛的应用前景。近些年，临床上将NK细胞用于免疫治疗的例子在不断增多。目前，体外扩增NK系统主要通过以下三种方法：一是采用免疫磁珠的方法从PBMC中将NK细胞分离出来再培养；二是单纯的细胞因子组合刺激PBMC中NK细胞的扩增。三是采用饲养细胞(基因修饰)的方法培养PBMC中的NK细胞。采用饲养细胞培养NK细胞可以获得大量高纯度NK细胞，但容易引来外来细胞系污染；所以饲养细胞的灭活方法是至关重要。常规灭活饲养细胞的方法有两种，一是γ射线或Co60放射灭活，二是细胞反复冻融的方法。射线能彻底灭活，但是对仪器设备要求高，试验成本高；反复冻融的方法对试验仪器要求低，但灭活不彻底，需要反复多次操作，很难保持细胞形态额完整性，从而影响NK刺激效果。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型灭活重组K562细胞联合细胞因子组合刺激NK细胞扩增的方法。该灭活处理方法对仪器设备要求低，成本低，操作过程简单可以被广泛应用。且本专利技术采用饲养细胞和细胞因子组合联合刺激的方法刺激PBMC中NK细胞的扩增，可以获得大量高效杀伤活性的NK细胞，培养过程简单，完全可以满足临床需要。本专利技术所提供的灭活饲养细胞联合细胞因子刺激NK细胞扩增的方法，包括以下步骤：1)配制次氯酸液用DPBS(TBD货号：PB2005Y)溶液将次氯酸钠(Sigma货号：239305-25ml)溶液配制成浓度为60mM的次氯酸储存液；2)然后将次氯酸储存液加入到重组K562细胞中，吹打混匀，次氯酸的使用浓度为60uM/ml，重组细胞浓度为1x106cells/ml；3)将细胞悬浮液放入37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱中培养1小时，期间每30min吹打混匀一次，诱导饲养细胞氧化死亡；4)1小时以后，100g，5min离心收集细胞，用DPBS洗涤，培养基(TAKARA货号：GT-T551-H3)重悬制成灭活重组K562细胞；5)将分离的人外周血单核细胞(PBMC)用培养基重悬，按1:1的比例加入灭活重组K562细胞，10％的自体血浆，添加细胞因子组合IL-2至终浓度为800U/ml，CD16mAb终浓度为600ng/ml，CD3mAb终浓度为20ng/ml；PBMC的接种浓度范围为1x106cells/ml-1.5x106cells/ml，放37℃，5％CO2培养箱中培养至第三天，补加添加了IL-2的新鲜培养基；6)培养期间每隔2或3天补加新添加了IL-2的新鲜培养基，维持细胞浓度在5x105cells/ml以上，在培养的第14天，离心收集全部培养所得细胞。本专利技术具有以下优势：(1)本专利技术制备得到的NK细胞，具有很高的纯度和杀伤活性，经检测培养至14天时，NK细胞纯度达90％以上；当效靶比为10:1时，NK细胞对K562细胞的杀伤活性为80％以上；(2)本专利技术制备的NK细胞增殖速度快，培养至14-17天细胞扩增倍数达500以上，本专利技术制备的NK细胞有很好的靶向杀伤肿瘤细胞的效果。附图说明图1为实施例1-2与对比实施例1-2第4-14天细胞增殖曲线的结果图；图2为实施例1-2与对比实施例1-2第14天得到的NK细胞比例结果图。具体实施方式本专利技术提供了一种新型灭活重组K562细胞联合细胞因子组合刺激NK细胞扩增的方法，该灭活方法对仪器设备要求低，灭活彻底，细胞形态保持完整，且能提高饲养细胞刺激NK细胞扩增效率。本专利技术采用次氯酸氧化饲养细胞的方法，此方法之前有用于灭活处理肿瘤细胞制备DC疫苗，但没有用于处理重组K562细胞等饲养细胞的报道。本专利技术采用新型方法灭活的饲养细胞与细胞因子组合联合刺激外周血中NK细胞，该方法可以更有效的刺激NK细胞扩增，并增加其杀伤活性。我们通过多组试验对比，发现采用本专利技术可以刺激PBMC产生大量高杀伤活性的NK细胞，可以安全有效的用于临床治疗。为了使本专利技术的技术方案和优点更加清楚明白，结合以下实施例进一步详细说明，本专利技术的实施方式及说明仅限于解释本专利技术，并不作对本专利技术的限定。实施例11分离PBMC：采集肿瘤患者外周血50ml，肝素抗凝，全血离心，700g，20min。上层为血浆层，中间为白膜层，下层为红细胞。收集血浆层，56℃，灭活30min，然后4℃，静置15min，1800rpm/800g，4℃，25min，上清作为自体血浆备用。收集中间白膜层，加到20mlPBS里面，混匀，然后以4:3的比例缓慢加入已经添加淋巴分离液的离心管，1800rpm/800g，室温，20min，no-break，洗涤PBMC；用巴斯德吸管将离心后中间白色的PBMC层吸出，在新的50ml离心管中加入30ml左右PBS清洗，1500rpm，8min，在用培养基洗一次，并计数。2NK细胞的诱导和扩增：(1)步骤1细胞总量为3.2^107cells，细胞一分为二，分别为A组和B组，转到两个T75cm2细胞培养瓶里面，然后按1:1的比例加入饲养细胞，A组加γ射线灭活的重组K562细胞，B组加入次氯酸氧化灭活的重组K562细胞，然后分别补加10％自体血浆和细胞因子组合(细胞因子组合：IL-2，终浓度800U/ml，CD16mAb终浓度600ng/ml，CD3mAb终浓度20ng/ml)，PBMC的接种浓度范围为1.2^106cells/ml，37℃，5％CO2培养箱中培养；(2)培养至第三天，对半补加新鲜培养基，其中其中IL-2的终浓度为50ng/ml；(3)以后每隔2或3天补加新鲜培养基和IL-2，IL-2的浓度为50ng/ml，维持细胞浓度在5^105cells/ml以上，每七天记录细胞扩增倍数和NK细胞纯度。3NK细胞生物学特性检测1)细胞增殖能力，细胞纯度，细胞活性检测取第14天细胞20ul加入0.1％台盼蓝20ul进行计数，统计NK细胞增殖力和细胞活力，培养至14天细胞扩增倍数为820倍，活细胞比例为93％。同时对第14天细胞做流式检测，测定NK细胞纯度，分别用CD56CD16、CD3抗体对扩增细胞进行流式分析，统计NK细胞的所占比例，CD3-CD16+的细胞占85％左右。同时还对扩增NK细胞的激活性受体和抑制性受体水平分别用CD16、CD69、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD158b抗体进行流式测定。2)NK细胞毒性检测96孔培养板,每孔含一定数量的NK细胞作为效应细胞，另加入一定数量的K562细胞作为靶细胞，按效靶比5:1、10:1、20:1、40本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种灭活饲养细胞联合细胞因子刺激NK细胞扩增的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：1)配制次氯酸液用DPBS溶液将次氯酸钠溶液配制成浓度为60mM的次氯酸储存液；2)然后将次氯酸储存液加入到重组K562细胞中，吹打混匀，3)将细胞悬浮液放入37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱中培养1小时，期间每30min吹打混匀一次，诱导饲养细胞氧化死亡；4)1小时以后，100g，5min离心收集细胞，用DPBS洗涤，培养基重悬制成灭活重组K562细胞；5)将分离的人外周血单核细胞用培养基重悬，按1:1的比例加入灭活重组K562细胞，10％的自体血浆，添加细胞因子组合IL‑2、CD16mAb和CD3mAb；PBMC的接种浓度范围为1x106cells/ml‑1.5x106cells/ml，放37℃，5％CO2培养箱中培养至第三天，补加添加了IL‑2的新鲜培养基；6)培养期间每隔2或3天补加新添加了IL‑2的新鲜培养基，维持细胞浓度在5x105cells/ml以上，在培养的第14天，离心收集全部培养所得细胞。

【技术特征摘要】
1.一种灭活饲养细胞联合细胞因子刺激NK细胞扩增的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：1)配制次氯酸液用DPBS溶液将次氯酸钠溶液配制成浓度为60mM的次氯酸储存液；2)然后将次氯酸储存液加入到重组K562细胞中，吹打混匀，3)将细胞悬浮液放入37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱中培养1小时，期间每30min吹打混匀一次，诱导饲养细胞氧化死亡；4)1小时以后，100g，5min离心收集细胞，用DPBS洗涤，培养基重悬制成灭活重组K562细胞；5)将分离的人外周血单核细胞用培养基重悬，按1:1的比例加入灭活重组K562细胞，10％的自体血浆，添加细胞因子组合IL-2、CD16mAb和CD3mAb；PBMC的接种浓度范围为1x106cells/ml-1.5x106cells/m...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛淑娟，徐矫健，刘燕丽，王玉娟，
申请(专利权)人：青岛麦迪赛斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37