外周血CTL细胞的培养方法技术

本发明专利技术涉及一种外周血CTL细胞的培养方法。该方法包括：1)将由外周血分离得到的PBMC接种于包被有CD3抗体及CD28抗体的培养容器中进行培养；培养体系中的细胞因子为IFN‑γ900U/mL～1100U/mL；2)向培养体系中加入IL‑1α和IL‑2，终浓度均为900U/mL～1100U/mL；培养体系中还加入有IL‑7，终浓度为4～6ng/mL；3)换液，新的培养体系中的细胞因子为IL‑2 900U/mL～1100U/mL，IL‑7，2～3ng/mL，基础培养基为含4％～6％自体血浆的VIVO培养基。该方法CTL扩增效果好，且活化的CTL占比更高、T‑reg细胞占比更低。

Culture of CTL cells from peripheral blood

The invention relates to a culture method of peripheral blood CTL cells. The method includes: 1) inoculating PBMC isolated from peripheral blood into a culture container coated with CD3 antibody and CD28 antibody for cultivation; the cytokines in the culture system are IFN_900U/mL~1100U/mL; 2) adding IL_1a and IL_2 to the culture system with the final concentration of 900U/mL~1100U/mL; and adding IL_7 to the culture system with the final concentration of 4-6ng/mL; 3) changing the medium, and a new one. The cytokines in the culture system were IL_2 900U/mL~1100U/mL, IL_7, 2~3ng/mL, and the basic medium was VIVO medium containing 4%~6% autologous plasma. The CTL amplification effect of this method is good, and the proportion of activated CTL is higher, and the proportion of T_reg cells is lower.

【技术实现步骤摘要】
外周血CTL细胞的培养方法
本专利技术涉及细胞培养
，具体而言，涉及一种外周血CTL细胞的培养方法。
技术介绍
细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxiclymphocyte,CTL)，是一种特异性，具有杀伤功能的T细胞，专门分泌各种细胞因子参与免疫作用。对某些病毒、肿瘤细胞等抗原物质具有杀伤作用，与自然杀伤细胞构成机体抗病毒、抗肿瘤免疫的重要防线。被激活的CTL能够产生特异性的肿瘤杀伤活性，这种细胞毒作用主要包括(1)穿孔素-颗粒酶途径(2)活化的CTL高表达FaSL,通过与靶细胞表面FaS抗原结合，可诱导靶细胞凋亡(3)分泌TNF等多种细胞因子直接杀伤靶细胞(4)产生多种趋化因子，吸引天然免疫细胞，杀伤靶细胞(5)释放多种丝氨酸酷酶，通过活化穿孔素而促进杀伤作用。细胞内感染和肿瘤的保护免疫主要依赖于细胞毒性T细胞(CTL)的应答，CTL对肿瘤细胞实施MHC限制性识别和特异性杀伤。体内外诱导、活化和扩增肿瘤反应性CTL是当前肿瘤免疫治疗研究的重大课题，具有巨大潜在意义。然而现有的CTL体外培育方法，普遍存在扩增CTL倍率低、细胞活性差等问题。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新颖的外周血细胞毒性T细胞(cytotoxiclymphocyte,CTL)的培养方法，该方法操作简单，培养得到CTL质量较好，可用于CTL的大量制备，使该方法更利于推广和应用。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：本专利技术涉及一种外周血CTL细胞的培养方法，包括：1)将由外周血分离得到的PBMC接种于包被有CD3抗体及CD28抗体的培养容器中进行培养；培养体系中的细胞因子为IFN-γ900U/mL～1100U/mL；2)向培养体系中加入IL-1α和IL-2，终浓度均为900U/mL～1100U/mL；培养体系中还加入有IL-7，终浓度为4～6ng/mL；3)换液，新的培养体系中的细胞因子为IL-2900U/mL～1100U/mL，IL-7，2～3ng/mL，所述培养体系中的基础培养基为含4％～6％自体血浆的VIVO培养基。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：CTL扩增效果好，且活化的CTL占比更高、T-reg细胞占比更低。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为对本专利技术一个实施例培养得到的树突状细胞表面标志物进行检测的结果。具体实施方式本专利技术涉及一种外周血CTL细胞的培养方法，包括：1)将由外周血分离得到的PBMC接种于包被有CD3抗体及CD28抗体的培养容器中进行培养；培养体系中的细胞因子为IFN-γ900U/mL～1100U/mL；2)向培养体系中加入IL-1α和IL-2，终浓度均为900U/mL～1100U/mL；培养体系中还加入有IL-7，终浓度为4～6ng/mL；3)换液，新的培养体系中的细胞因子为IL-2900U/mL～1100U/mL，IL-7，2～3ng/mL，所述培养体系中的基础培养基为含4％～6％自体血浆的VIVO培养基。在一些实施方式中，在步骤1)中，培养体系中的细胞因子为IFN-γ950U/mL～1050U/mL。在一些实施方式中，在步骤1)中，培养体系中的细胞因子为IFN-γ1000U/mL。在一些实施方式中，在步骤2)中，培养体系中加入IL-1α和IL-2的终浓度均为950U/mL～1050U/mL；加入IL-7，终浓度为4.5～5.5ng/mL。在一些实施方式中，在步骤2)中，培养体系中加入IL-1α和IL-2的终浓度均为1000U/mL；加入IL-7，终浓度为5ng/mL。在一些实施方式中，在步骤3)中，新的培养体系中的细胞因子为IL-2950U/mL～1050U/mL，IL-72.2～2.8ng/mL。在一些实施方式中，在步骤3)中，新的培养体系中的细胞因子为IL-21000U/mL，IL-72.5ng/mL。在一些实施方式中，在步骤1)中，所述培养容器包被有CD3抗体及CD28抗体的方法为：以所述培养面积为25cm2计，加入2.5～3.5mL含有CD3抗体400ng/mL～600ng/mL及CD28抗体400ng/mL～600ng/mL的包被液，在细胞培养条件下包被1.5h～2.5h。如非特别强调，本申请所述方法涉及到的细胞培养条件均在30至45℃之间和在1至10％的CO2之间，优选为36至38℃之间和在4至6％的CO2之间。加CD3，CD28的抗体是为了模拟T细胞的TCR激活和共刺激信号，是为了让T细胞活化进入到增殖的状态。在一些实施方式中，CD3抗体的浓度为500ng/mL。在一些实施方式中，CD28抗体的浓度为500ng/mL。在一些实施方式中，所述包被液的溶剂为D-PBS。在一些实施方式中，在步骤1)中，所述培养体系中的基础培养基为含5％自体血浆的VIVO培养基。在一些实施方式中，在步骤1)中，以所述培养面积为25cm2计，培养基的加入量为8ml～12ml，细胞接种量为0.8×107～1.2×107。在一些实施方式中，在步骤1)中，以所述培养面积为25cm2计，培养基的加入量为10ml，细胞接种量为1.0×107。在一些实施方式中，步骤1)的培养时间为20h～28h。在一些实施方式中，步骤1)的培养时间为24h。在一些实施方式中，步骤2)的培养时间为2d～4d。在一些实施方式中，步骤2)的培养时间为3d。在一些实施方式中，在步骤3)中，所述培养体系中的基础培养基为含4％～6％自体血浆的VIVO培养基。在一些实施方式中，在步骤3)中，所述培养体系中的基础培养基为含5％自体血浆的VIVO培养基。在一些实施方式中，在步骤3)中，将细胞扩增2～3次。在一些实施方式中，步骤3)的培养时间为9d～11d。在一些实施方式中，步骤3)的培养时间为10d。在一些实施方式中，步骤3)具体包括：a)以培养面积为75cm2计，加入15～25ml培养基培养3d；b)换液，以培养面积为175cm2计，加入60ml～80ml培养基培养3d；c)换液，使用培养袋进行培养，加入300ml～400ml培养基培养4d。下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1本实施例涉及一种外周血CTL的培养方法。1.外周血CTL细胞培养基1)包被液：D-PBS，CD3单抗浓度400ng/mL，CD28抗体浓度600ng/mL。2)CTL初始培养基：VIVO培养基(含4％自体血浆)，IFN-γ900U/mL。3)CTL培养基：VIVO培养基(含4％自体血浆)，IL-2浓度1100U/mL，IL-72ng/mL。2.外周血CTL培养细胞方法1)培养第0天，取T25培养瓶，加入2.5mL包被液，置于培养箱中包被2.5h，备用。取出包被好的T2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种外周血CTL细胞的培养方法，其特征在于，包括：1)将由外周血分离得到的PBMC接种于包被有CD3抗体及CD28抗体的培养容器中进行培养；培养体系中的细胞因子为IFN‑γ900U/mL～1100U/mL；2)向培养体系中加入IL‑1α和IL‑2，终浓度均为900U/mL～1100U/mL；培养体系中还加入有IL‑7，终浓度为4～6ng/mL；3)换液，新的培养体系中的细胞因子为IL‑2 900U/mL～1100U/mL，IL‑72～3ng/mL，所述培养体系中的基础培养基为含4％～6％自体血浆的VIVO培养基。

【技术特征摘要】
1.一种外周血CTL细胞的培养方法，其特征在于，包括：1)将由外周血分离得到的PBMC接种于包被有CD3抗体及CD28抗体的培养容器中进行培养；培养体系中的细胞因子为IFN-γ900U/mL～1100U/mL；2)向培养体系中加入IL-1α和IL-2，终浓度均为900U/mL～1100U/mL；培养体系中还加入有IL-7，终浓度为4～6ng/mL；3)换液，新的培养体系中的细胞因子为IL-2900U/mL～1100U/mL，IL-72～3ng/mL，所述培养体系中的基础培养基为含4％～6％自体血浆的VIVO培养基。2.根据权利要求1所述的外周血CTL细胞的培养方法，其特征在于，在步骤1)中，所述培养容器包被有CD3抗体及CD28抗体的方法为：以所述培养面积为25cm2计，加入2.5～3.5mL含有CD3抗体400ng/mL～600ng/mL及CD28抗体400ng/mL～600ng/mL的包被液，在细胞培养条件下包被1....

【专利技术属性】
技术研发人员：施琳，
申请(专利权)人：汇麟生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11