一种适用于恶性实体瘤肿瘤浸润T淋巴细胞的分离诱导方法技术

本发明专利技术提供了一种适用于恶性实体瘤肿瘤浸润T淋巴细胞的分离诱导方法，具体地，包括1)将肿瘤组织加工成体积为0.5‑3mm

【技术实现步骤摘要】
一种适用于恶性实体瘤肿瘤浸润T淋巴细胞的分离诱导方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种适用于恶性实体瘤肿瘤浸润T淋巴细胞的分离诱导方法。
技术介绍
目前对于肿瘤的治疗主要的治疗手段包括传统的放射治疗、手术切除肿瘤、药物治疗以及新兴的肿瘤生物治疗。由于手术、放化疗在治疗中会给患者带来巨大的毒副作用，因此生物治疗凭借其显著疗效的优势成为第四种重要的肿瘤治疗模式。肿瘤生物治疗主要包括：过继细胞治疗、细胞因子治疗、肿瘤疫苗、靶向分子治疗等。目前关于过继细胞治疗的研究比较多，其中包括了肿瘤浸润T淋巴细胞(tumor-infiltratinglymphocytes，TIL)，其主要为聚集在肿瘤病灶区域内的CD8+T淋巴细胞，在肿瘤免疫机制中处于免疫应答和调控作用的前沿。目前本领域体外分离恶性实体瘤TIL方法主要有采用机械解聚、酶消化和非连续密度梯度离心的方法进行分离。这些经典的分离TIL细胞肿瘤杀伤活性的方法需要从患者肿瘤组织分离并诱导培养出原代肿瘤细胞作为靶细胞，并经过体外TIL细胞与靶细胞的共培养(例如24小时)，耗时较长；且从肿瘤组织分离培养原代肿瘤细胞以及肿瘤局部浸润性CD8+T淋巴细胞也颇具难度，所以，迫切需要建立高效、易行的方法分离、鉴定患者肿瘤浸润T淋巴细胞，以便应用于肿瘤的免疫治疗。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种从恶性实体瘤中分离、诱导、培养肿瘤浸润T淋巴细胞的方法。此法操作简单、方便、适合所有恶性实体瘤肿瘤浸润T淋巴细胞的分离。在一个实施方案中，本专利技术提供一种适用于恶性实体瘤肿瘤浸润T淋巴细胞的分离诱导方法，其包括：1)将肿瘤组织加工成体积为0.5-3mm3的组织块；2)将基质胶铺于细胞培养板中，并将在步骤1)中经加工的肿瘤组织的组织块转移到基质胶中进行包被；3)将步骤2)中经包被的组织块转移到另一细胞培养板中，并孵育10-60分钟；4)向步骤3)中的细胞培养板中加入预扩增培养基，进行预扩增培养10-30天，每2-3天采用预扩增培养基半量换液。在一个具体的实施方案中，所述的适用于恶性实体瘤肿瘤浸润T淋巴细胞的分离诱导方法还包括步骤5)：替换步骤4)中的预扩增培养基为快速扩增培养基进一步培养7-14天，每2-3天采用快速扩增培养基半量换液。在一个可选的实施方案中，所述预扩增培养基为补充有50-500ng/ml兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白、10-30ng/mlIL-7、10-30ng/mlIL-15、10-30ng/mlIL-21和1-5％(v/v)SUPERGROW细胞培养添加物的基础培养基。在一个可选的实施方案中，所述预扩增培养基中的兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白的浓度为100-400ng/ml，优选150-350ng/ml，更优选200-300ng/ml；IL-7的浓度为15-25ng/ml，优选20-25ng/ml；IL-15的浓度为15-25ng/ml，优选20-25ng/ml；IL-21的浓度为15-25ng/ml，优选20-25ng/ml；SUPERGROW细胞培养添加物在预扩增培养基中的体积比为1.5-4.5％(v/v)，优选2-4％(v/v)，更优选2.5-3.5％(v/v)。在一个优选的实施方案中，所述预扩增培养基为补充有100ng/ml兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白、20ng/mlIL-7、20ng/mlIL-15、20ng/mlIL-21和2.5％(v/v)SUPERGROW细胞培养添加物的基础培养基。在一个可选的实施方案中，所述快速扩增培养基为补充有1-5％(v/v)SUPERGROW细胞培养添加物、50-500ng/ml兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白、5000-8000IU/mlIL-2的基础培养基。在一个优选的实施方案中，IL-2为注射用重组人IL-2。在一个可选的实施方案中，SUPERGROW细胞培养添加物在所述快速扩增培养基中的体积比为1.5-4.5％(v/v)，优选2-4％(v/v)，更优选2.5-3.5％(v/v)；所述快速扩增培养基中的兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白的浓度为100-400ng/ml，优选150-350ng/ml，更优选200-300ng/ml；IL-2的含量为5500-7500IU/ml，优选6000-7000IU/ml，更优选6000-6500IU/ml。在一个优选的实施方案中，所述快速扩增培养基为补充有2.5％(v/v)SUPERGROW细胞培养添加物、100ng/ml兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白、6000IU/mlIL-2的基础培养基。在上述实施方案中，基础培养基是指未添加血清和其他添加剂的任何商业可获得的细胞培养基，例如但不限于Lonza销售的货号为：04-418Q的X-VIVO15培养基。在一个具体的实施方案中，所述基质胶为：BDMatrigelTM基底膜基质。在其他实施方案中，也可选择其他基质胶或其等同物，例如纤连蛋白、多聚赖氨酸。在一个具体的实施方案中，BDMatrigelTM基底膜基质采用基础培养基5-15倍稀释。如前所述，基础培养基是指未添加血清和其他添加剂的任何商业可获得的细胞培养基，例如Lonza销售的货号为：04-418Q的X-VIVO15培养基。优选地，采用冷的(4℃)基础培养基(Lonza)将BDMatrigelTM基底膜基质进行10倍稀释。在一个具体的实施方案中，在步骤1)中，将肿瘤组织加工成体积为1-2mm3的组织块。在一个具体的实施方案中，在步骤2)中，在4℃条件下将经加工的肿瘤组织的组织块转移到基质胶中进行包被2-8分钟，优选3-7分钟，更优选4-6分钟，最优选5分钟。在一个具体的实施方案中，在步骤3)中，将经包被的组织块转移到另一细胞培养板中，并在37℃，5％CO2下孵育10-60分钟；优选孵育20-50分钟，更优选20-40分钟，最优选30分钟。在一个具体的实施方案中，在步骤4)中，向细胞培养板中加入预扩增培养基，进行预扩增培养10-30天，每2-3天采用预扩增培养基半量换液，其中，当培养到5-15天时，镜下可看到肿瘤浸润T淋巴细胞或成纤维细胞生长，去除组织块，继续培养5-15天。在一个具体的实施方案中，所述的适用于恶性实体瘤肿瘤浸润T淋巴细胞的分离诱导方法包括：1)肿瘤组织的处理取出肿瘤组织，用含有抗生素的PBS冲洗液冲洗和浸泡，去除脂肪、血管和坏死组织。剩余肿瘤组织用手术剪子剪成组织块后，改用眼科剪子进一步加工成体积较小(约1-2mm3)组织块。较小组织块用离心法或换液法冲洗一次待用。2)小组织块的包被处理取1管(-20℃)冻存的基质胶储存液(经分装，1ml/2mlEP管)，置4℃冰箱过夜融化，用冷的(4℃)基础培养基进行10倍稀释，在4℃条件下加入一次性塑料平皿内，将上述制备好的小组织块转移到胶液中，使组织块充分浸入胶液中，让胶液包被组织。3)组织块接种用眼科镊子夹取胶液包被的组织块，均匀摆放在6孔培养板底部(接种)，相邻组织间隔一定距离。接种组织块的培养板放置在培养箱内(37℃，5％CO2)孵育30分钟。4)组织块(原代肿瘤浸润T淋巴细胞)预扩增培养30分钟后，取出培养板，肉眼观察基质胶已凝固，组织块不再移动。在各孔内小心加入5ml预扩增培养基，将培养板放置在培养箱内连续培养，直到淋巴细胞移出和增殖，每2-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种适用于恶性实体瘤肿瘤浸润T淋巴细胞的分离诱导方法，其包括：1)将肿瘤组织加工成体积为0.5‑3mm3的组织块；2)将基质胶铺于细胞培养板中，并将在步骤1)中经加工的肿瘤组织的组织块转移到基质胶中进行包被；3)将步骤2)中经包被的组织块转移到另一细胞培养板中，孵育10‑60分钟；4)向步骤3)中的细胞培养板中加入预扩增培养基，进行预扩增培养10‑30天，每2‑3天采用预扩增培养基半量换液。

【技术特征摘要】
1.一种适用于恶性实体瘤肿瘤浸润T淋巴细胞的分离诱导方法，其包括：1)将肿瘤组织加工成体积为0.5-3mm3的组织块；2)将基质胶铺于细胞培养板中，并将在步骤1)中经加工的肿瘤组织的组织块转移到基质胶中进行包被；3)将步骤2)中经包被的组织块转移到另一细胞培养板中，孵育10-60分钟；4)向步骤3)中的细胞培养板中加入预扩增培养基，进行预扩增培养10-30天，每2-3天采用预扩增培养基半量换液。2.根据权利要求1所述的适用于恶性实体瘤肿瘤浸润T淋巴细胞的分离诱导方法，其还包括步骤5)，替换步骤4)中的预扩增培养基为快速扩增培养基进一步培养7-14天，每2-3天采用快速扩增培养基半量换液。3.根据权利要求1所述的适用于恶性实体瘤肿瘤浸润T淋巴细胞的分离诱导方法，其中，所述预扩增培养基为补充有50-500ng/ml兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白、10-30ng/mlIL-7、10-30ng/mlIL-15、10-30ng/mlIL-21和1-5％(v/v)SUPERGROW细胞培养添加物的基础培养基。4.根据权利要求3所述的适用于恶性实体瘤肿瘤浸润T淋巴细胞的分离诱导方法，其中，所述预扩增培养基为补充有100ng/ml兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白、20...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜丽君，李超，张强，毕薇薇，张立娜，
申请(专利权)人：吉林省拓华生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22