一种可控结晶度细菌纤维素基因工程生产菌的构建方法及其产物和应用技术

本发明专利技术提供了一种可控结晶度细菌纤维素基因工程生产菌的构建方法，其构建得到的工程菌株及应用，属于生物技术和生物材料领域。本发明专利技术提供的构件方法先以Enterobacter sp.FY‑07基因组为模板，扩增得到可拉酸基因簇原启动子上游同源臂基因和下游同源臂基因；然后将上游同源臂基因、tac启动子、下游同源臂基因融合，得到融合片段；再将融合片段插入骨架质粒，得到重组质粒；最后将重组质粒转移至Enterobacter sp.FY‑07菌株中，得到可控结晶度细菌纤维素基因工程生产菌。利用本发明专利技术所述基因工程生产菌合成的细菌纤维素具有明显降低的结晶度、减弱的机械性能、均匀的三维网络结构和显著改善的持水率。

【技术实现步骤摘要】
一种可控结晶度细菌纤维素基因工程生产菌的构建方法及其产物和应用
本专利技术属于生物技术和生物材料领域，具体涉及一种可控结晶度细菌纤维素基因工程生产菌的构建方法及其产物和应用。
技术介绍
细菌纤维素(BacterialCellulose，简称BC)是由部分细菌产生的水不溶性胞外多糖聚合物，它是由D-吡喃葡萄糖通过β-1，4糖苷键连接形成葡萄糖苷链直链。与自然界中存在的植物纤维素相比，细菌纤维素具有许多优良特性，如高纯度、高结晶度、高亲水性、高抗张强度、生物相容性、生物可降解性等。这些性质使其广泛应用于食品、造纸、石油开采、医药、化妆品、生物膜等领域。目前生产细菌纤维素的模式菌株是Gluconacetobacter，该菌株是严格的好氧菌株，静置发酵条件下，氧气的浓度极大程度上影响最终纤维素的产量。虽然已经采用通气、搅拌、间歇型发酵罐等发酵方式来增加纤维素产量，但这也无疑增加生产成本，同时所产纤维素在性质上也存在着差异。与此同时，细菌纤维素也存在一些缺点，如结晶度太高、再水化能力差、官能团单一、可塑性较差、不易在水和一般有机、无机溶剂中溶解，致使纤维素成型、加工和应用均受到很大限制。为了充分利用细菌纤维素的现有特性并赋予细菌纤维素新的特性，近年来关于细菌纤维素的改性研究越来越深入。有大量研究尝试对细菌纤维素进行改性以改善其物理化学性质。细菌纤维素的改性方法有很多，包括化学表面修饰和原位改性。经发酵获得的纤维素膜经过化学表面修饰，能够赋予纤维素新的功能。然而，这种改性策略需要复杂的化学反应和大量的工作，存在工序繁琐、成本昂贵等问题。原位改性一般是在发酵培养基中添加物质，使纤维素的结构和性能得到改性，无需复杂的后处理或较大的成本投入。但在发酵培养基中外源添加改性剂，存在以下问题：纤维素不能被适量的改性剂充分改性，而过量的改性剂会堵塞已充分改性纤维素的矩阵网格。如果在发酵培养基中加入适量的改性剂，很难获得均匀的改性纤维素，因为在发酵培养基中纤维素浓度逐渐增加，而改性剂的浓度却稳步下降。因此，与发酵前期产生的改性纤维素相比，发酵后期产生的纤维素由于改性剂的不足而难以得到充分的改性。相反，如果在发酵培养基中添加过量的改性剂，发酵后期产生的纤维素也可以进行充分的改性，而残留的改性剂则粘附在纤维素的纤维束和网络上。
技术实现思路
鉴于
技术介绍
中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种可控结晶度细菌纤维素基因工程生产菌的构建方法、其构建得到的工程菌株及应用。本专利技术提供了一种可控结晶度细菌纤维素基因工程生产菌Enterobactersp.FY-07::tac的构建方法，包括如下步骤：(1)以Enterobactersp.FY-07基因组DNA为模板，扩增得到可拉酸基因簇原启动子上游同源臂基因和下游同源臂基因；(2)将上游同源臂基因、tac启动子、下游同源臂基因依次融合，得到融合片段；(3)将所述融合片段插入骨架质粒，得到重组质粒；(4)将所述重组质粒转移至Enterobactersp.FY-07菌株中，得到可控结晶度细菌纤维素基因工程生产菌Enterobactersp.FY-07::tac。优选的，所述步骤(1)中上游同源臂基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；下游同源臂基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。优选的，所述步骤(2)中tac启动子以pMMB66eh质粒为模板扩增获得。优选的，所述tac启动子的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。优选的，所述步骤(3)中骨架质粒为pTSK-1。优选的，所述步骤(4)中转移的方法为接合转移；所述接合转移的供体细胞为E.coliS17。本专利技术提供了上述构建方法构建得到的可控结晶度细菌纤维素基因工程生产菌Enterobactersp.FY-07::tac。本专利技术还提供了上述构建方法或者上述构建方法构建得到的可控结晶度细菌纤维素基因工程生产菌Enterobactersp.FY-07::tac在生产细菌纤维素中的应用。本专利技术提供了一种可控结晶度细菌纤维素的生产方法，包括如下步骤：①将上述基因工程生产菌Enterobactersp.FY-07::tac于LB培养基中活化，斜面富集培养，用无菌水冲洗斜面，得到菌悬液；②将所述菌悬液按照0.5～3％的接种量接种于Li-Zhao培养基，25～35℃静置发酵；所述Li-Zhao培养基包括如下重量百分比的组分：葡萄糖2～3％，KNO30.05～0.15％，Na2HPO40.5～1.5％，MnCl20.01～0.03％，MgSO4·7H2O0.02～0.03％和NaSO40.03～0.035％；③待所述发酵6～10h后，向发酵用培养基中加入0.1～1mmol/L的IPTG，继续培养24～72h，收获细菌纤维素。优选的，所述LB培养基的pH值为7.2～7.4；所述LB培养基包括如下重量百分比的组分：蛋白胨0.5～2％，酵母粉0.2～0.8％和氯化钠0.2～0.8％。有益效果：本专利技术提供了一种可控结晶度细菌纤维素基因工程生产菌Enterobactersp.FY-07::tac的构建方法，包括如下步骤：(1)以Enterobactersp.FY-07基因组DNA为模板，扩增得到可拉酸基因簇原启动子上游同源臂基因和下游同源臂基因；(2)将上游同源臂基因、tac启动子、下游同源臂基因依次融合，得到融合片段；(3)将所述融合片段插入骨架质粒，得到重组质粒；(4)将所述重组质粒转移至Enterobactersp.FY-07菌株中，得到可控结晶度细菌纤维素基因工程生产菌Enterobactersp.FY-07::tac。利用本专利技术所述基因工程生产菌合成的细菌纤维素具有明显降低的结晶度、减弱的机械性能、均匀的三维网络结构和显著改善的持水率，具有重要的工业应用价值。附图说明图1为Enterobactersp.FY-07中CA生物合成基因簇(上)和诱导型CA生物合成基因簇(下)图谱；图2表示Enterobactersp.FY-07静置发酵过程中bcsA和wza的转录水平；图3表示不同IPTG诱导浓度下Enterobactersp.FY-07::tac中wca操纵子的转录水平；图4表示不同IPTG诱导浓度下Enterobactersp.FY-07::tac产生MBCs的结晶度；图5表示Enterobactersp.FY-07::tac在不同IPTG诱导浓度下产生的MBCs的微观结构，其中，a、b、c、d、e、f、g、h的诱导浓度依次为0mmol/L、0.1mmol/L；0.2mmol/L；0.4mmol/L；0.5mmol/L；0.6mmol/L；0.8mmol/L；1.0mmol/L；图6表示Enterobactersp.FY-07::tac在不同IPTG诱导浓度下产生的MBCs的流变学性质；图7表示Enterobactersp.FY-07::tac在不同IPTG诱导浓度下产生MBCs的持水率(WHC)；图8为水溶性多糖合成基因簇的鉴定结果；其中，图8-a表示来自Enterobactersp.FY-07ΔbcsIII的不同基因敲除菌株的琼脂糖凝胶电泳结果(为了单独验证caJ、caK和caJcaK的敲除，设计了两对引物。一对在敲除片段外侧，另一对在敲除片段内部，这样可本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可控结晶度细菌纤维素基因工程生产菌Enterobacter sp.FY‑07::tac的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)以Enterobacter sp.FY‑07基因组DNA为模板，扩增得到可拉酸基因簇原启动子上游同源臂基因和下游同源臂基因；(2)将上游同源臂基因、tac启动子、下游同源臂基因依次融合，得到融合片段；(3)将所述融合片段插入骨架质粒，得到重组质粒；(4)将所述重组质粒转移至Enterobacter sp.FY‑07菌株中，得到可控结晶度细菌纤维素基因工程生产菌Enterobacter sp.FY‑07::tac。

【技术特征摘要】
1.一种可控结晶度细菌纤维素基因工程生产菌Enterobactersp.FY-07::tac的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)以Enterobactersp.FY-07基因组DNA为模板，扩增得到可拉酸基因簇原启动子上游同源臂基因和下游同源臂基因；(2)将上游同源臂基因、tac启动子、下游同源臂基因依次融合，得到融合片段；(3)将所述融合片段插入骨架质粒，得到重组质粒；(4)将所述重组质粒转移至Enterobactersp.FY-07菌株中，得到可控结晶度细菌纤维素基因工程生产菌Enterobactersp.FY-07::tac。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中上游同源臂基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；下游同源臂基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中tac启动子以pMMB66eh质粒为模板扩增获得。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述tac启动子的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中骨架质粒为pTSK-1。6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)中转移的方法为接合转移；所述接合转移的供体细胞为...

【专利技术属性】
技术研发人员：李国强，马挺，刘丹，高歌，吴萌萌，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津,12