一种提高乳酸菌对酸性条件的耐受能力的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高乳酸菌对酸性条件的耐受能力的方法，属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明专利技术通过在乳酸乳球菌中过量表达GlnP或GlnQ蛋白，得到了在酸性条件下的耐受能力显著提高的重组乳酸乳球菌L lactis(GlnP)以及L lactis(GlnQ)；利用本发明专利技术的方法得到的重组乳酸乳球菌L lactis(GlnP)对在酸性条件下的耐受能力较对照菌株有了明显的提高，其对乳酸的耐受能力较对照菌株提高了15.2倍；利用本发明专利技术的方法得到的重组乳酸乳球菌L lactis(GlnQ)在酸性条件下的耐受能力较对照菌株有了明显的提高，其对乳酸的耐受能力较对照菌株提高了11.4倍。

【技术实现步骤摘要】
一种提高乳酸菌对酸性条件的耐受能力的方法
本专利技术涉及一种提高乳酸菌对酸性条件的耐受能力的方法，属于基因工程以及微生物工程

技术介绍
乳酸菌(LacticAcidBacteria，LAB)是人类应用最早的细菌之一，早在公元前3世纪，我们的祖先就用它来制作泡菜和腌菜，长期以来，这些细菌一直被用于食品的加工制作。同时，乳酸菌中的部分益生菌不仅可以提高食品的营养价值，改善食品风味，提高食品保藏性和附加值，而且作为人体胃肠道的益生菌群，具有维持肠道内菌群平衡、提高机体免疫力和促进营养物质吸收等多种功能。但是，在食品工业生产过程中，随着乳酸菌菌体的代谢生长过程，酸性物质也随之产生并积累；此外，当乳酸菌被食用后进入胃，胃酸的产生会使胃中的pH值极低，因此，在乳酸菌的在食品工业生产过程中以及作为益生菌在人体胃肠道系统发挥作用的过程中，不可避免的面临着来自外界环境的多种环境胁迫，包括酸胁迫、乙醇胁迫、氧胁迫、盐胁迫等，这些环境胁迫均严重限制着乳酸菌生长性能。而在乳酸菌面临的众多胁迫条件中，酸胁迫是影响其生理活性的重要胁迫条件。酸胁迫是由乳酸菌代谢产物乳酸、乙酸等酸性物质造成的，随着菌体的代谢生长过程，酸性物质也随之产生并积累，这些积累的乳酸、乙酸等酸性物质通过被动扩散进入细胞质，由于胞内的pH通常较胞外的pH高0.5～1.0，进入胞内的乳酸、乙酸等迅速解离，导致胞内pH的快速降低，使得细胞面临严重的酸胁迫，严重影响了细胞的生理活性，大大降低了乳酸菌食品微生物制造的效率，其中，以乳酸的积累导致的酸胁迫是最重要的胁迫之一。对于酸胁迫，为维持乳酸菌发酵生产的稳定性并提高生产效率，过去，工业上常常通过在乳酸菌发酵的过程中添加外源中和剂来维持pH处于稳定的范围，例如，通过添加碱性物质(氨水或NaOH)来控制发酵环境的pH值。然而，碱性物质的添加往往会导致副产物的积累，而副产物中形成的盐类会再次导致细胞处于高渗的环境，从而造成渗透压胁迫的产生，再次影响菌体的生长与代谢。因此，急需找到一种可提高乳酸菌在酸性条件下的耐受能力的方法。
技术实现思路
[技术问题]本专利技术要解决的技术问题是提供一种可提高乳酸菌对酸性条件的耐受能力的方法。[技术方案]为解决上述问题，本专利技术提供了一种提高乳酸菌对酸性条件的耐受能力的方法，所述方法为以乳酸菌为宿主，过量表达微生物细胞膜上用于转运谷氨酰胺的谷氨酰胺ABC转运蛋白GlnP和/或微生物细胞膜上用于转运谷氨酸和天冬氨酸的谷氨酰胺转运ATP结合蛋白GlnQ。在本专利技术的一种实施方式中，所述谷氨酰胺ABC转运蛋白GlnP和/或谷氨酰胺转运ATP结合蛋白GlnQ来源于乳酸乳球菌LactococcuslactisNZ9000。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述谷氨酰胺ABC转运蛋白GlnP的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；编码所述谷氨酰胺转运ATP结合蛋白GlnQ的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述过量表达为先将编码谷氨酰胺ABC转运蛋白GlnP和/或谷氨酰胺转运ATP结合蛋白GlnQ的基因与表达载体构建含有编码谷氨酰胺ABC转运蛋白GlnP和/或谷氨酰胺转运ATP结合蛋白GlnQ的基因的重组质粒，再将重组质粒导入乳酸菌中。在本专利技术的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌LactococcuslactisNZ9000。在本专利技术的一种实施方式中，所述表达载体为pNZ8148载体。在本专利技术的一种实施方式中，所述表达载体为pNZ8148载体时，构建含有编码谷氨酰胺ABC转运蛋白GlnP的基因的重组质粒的方法为先以L.lactisNZ9000的基因组为模板，分别以核苷酸序列如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6所示的基因片段为引物，通过PCR扩增获得核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的基因片段，然后将核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的基因片段与pNZ8148载体通过限制性内切酶进行双酶切得到酶切产物，最后将得到的酶切产物进行连接，得到含有编码谷氨酰胺ABC转运蛋白GlnP的基因的重组质粒。在本专利技术的一种实施方式中，所述构建含有编码谷氨酰胺ABC转运蛋白GlnP的基因的重组质粒时，使用的限制性内切酶为NcoI以及XbaI。在本专利技术的一种实施方式中，所述表达载体为pNZ8148载体时，构建含有编码谷氨酰胺转运ATP结合蛋白GlnQ的基因的重组质粒的方法为先以L.lactisNZ9000的基因组为模板，分别以核苷酸序列如SEQIDNO.7、SEQIDNO.8所示的基因片段为引物，通过PCR扩增获得核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的基因片段，然后将核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的基因片段与pNZ8148载体通过限制性内切酶进行双酶切得到酶切产物，最后将得到的酶切产物进行连接，得到含有编码谷氨酰胺转运ATP结合蛋白GlnQ的基因的重组质粒。在本专利技术的一种实施方式中，所述构建含有编码谷氨酰胺转运ATP结合蛋白GlnQ的基因的重组质粒时，使用的限制性内切酶为NcoI以及HindIII。本专利技术还提供了利用上述方法制备得到的在酸性条件下的耐受能力提高的乳酸菌。本专利技术还提供了上述方法在提高乳酸菌在酸性条件下的耐受能力方面的应用。本专利技术还提供了上述方法或上述制备得到的在酸性条件下的耐受能力提高的乳酸菌在制备食品、药品、饲料以及化学品方面的应用。[有益效果](1)本专利技术首次发现在乳酸菌中过量表达GlnP或GlnQ蛋白可显著提高乳酸菌在酸性条件下的耐受能力；(2)本专利技术通过在乳酸乳球菌中过量表达GlnP或GlnQ蛋白，得到了在酸性条件下的耐受能力显著提高的重组乳酸乳球菌Llactis(GlnP)以及Llactis(GlnQ)；(3)利用本专利技术的方法得到的重组乳酸乳球菌Llactis(GlnP)对在酸性条件下的耐受能力较野生型有了明显的提高，其对乳酸的耐受能力较对照菌株提高了15.2倍；利用本专利技术的方法得到的重组乳酸乳球菌Llactis(GlnQ)对在酸性条件下的耐受能力较对照菌株有了明显的提高，其对乳酸的耐受能力较对照菌株提高了11.4倍；(4)利用本专利技术的方法得到的重组乳酸乳球菌在构建时具有成本低、成功率高、操作简单、工作量少、效率高的优势，可适应大规模工业化生产。附图说明图1：重组质粒pNZ8148-glnP的结构图。图2：重组质粒pNZ8148-glnQ的结构图。图3：重组质粒pNZ8148-oppB的结构图。图4：重组质粒pNZ8148-malF的结构图。图5：重组菌株Llactis(GlnP)、Llactis(GlnQ)、Llactis(OppB)、Llactis(MalF)和对照菌株的生长曲线。图6：pH4.0(乳酸调节)条件下重组菌株Llactis(GlnP)与对照菌株的存活率对比。图7：pH4.0(乳酸调节)条件下重组菌株Llactis(GlnQ)与对照菌株的存活率对比。图8：重组菌株Llactis(GlnP)和对照菌株酸胁迫前后的胞内ATP含量对比。图9：重组菌株Llactis(GlnQ)和对照菌株酸胁迫前后的胞内ATP含量对比。图10：重组菌株Llactis(GlnP)和对照菌株酸胁迫前后的胞内谷氨酸含本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高乳酸菌对酸性条件的耐受能力的方法，其特征在于，所述方法为以乳酸菌为宿主，过量表达微生物细胞膜上用于转运谷氨酰胺的谷氨酰胺ABC转运蛋白GlnP和/或微生物细胞膜上用于转运谷氨酸和天冬氨酸的谷氨酰胺转运ATP结合蛋白GlnQ。

【技术特征摘要】
1.一种提高乳酸菌对酸性条件的耐受能力的方法，其特征在于，所述方法为以乳酸菌为宿主，过量表达微生物细胞膜上用于转运谷氨酰胺的谷氨酰胺ABC转运蛋白GlnP和/或微生物细胞膜上用于转运谷氨酸和天冬氨酸的谷氨酰胺转运ATP结合蛋白GlnQ。2.如权利要求1所述的一种提高乳酸菌对酸性条件的耐受能力的方法，其特征在于，编码所述谷氨酰胺ABC转运蛋白GlnP的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；编码所述谷氨酰胺转运ATP结合蛋白GlnQ的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.如权利要求1或2所述的一种提高乳酸菌对酸性条件的耐受能力的方法，其特征在于，所述过量表达为先将编码谷氨酰胺ABC转运蛋白GlnP和/或谷氨酰胺转运ATP结合蛋白GlnQ的基因与表达载体构建含有编码谷氨酰胺ABC转运蛋白GlnP和/或谷氨酰胺转运ATP结合蛋白GlnQ的基因的重组质粒，再将重组质粒导入乳酸菌中。4.如权利要求3所述的一种提高乳酸菌对酸性条件的耐受能力的方法，其特征在于，所述表达载体为pNZ8148载体。5.如权利要求4所述的一种提高乳酸菌对酸性条件的耐受能力的方法，其特征在于，所述表达载体为pNZ8148载体时，构建含有编码谷氨酰胺ABC转运蛋白GlnP的基因的重组质粒的方法为先以LactococcuslactisNZ9000的基因组为模板，分别以核苷酸序列如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6所示的基因片段为引物，通过PCR扩增获得核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的基因片段，然后将核苷酸序列如SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：张娟，杨佩珊，刘为佳，朱政明，陈坚，堵国成，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32