【技术实现步骤摘要】
整合双拷贝功能性F4菌毛操纵子基因猪源益生菌EP1克隆株、构建方法及应用
本专利技术涉及到生物技术应用领域，具体涉及到大肠杆菌的染色体稳定遗传表达外源功能性F4菌毛蛋白。
技术介绍
大肠杆菌NY10(EP1)是由本实验室上世纪50年代从腹泻严重的猪场中无腹泻猪只粪便中分离出的对猪腹泻病有很好预防作用，是一种猪源性大肠杆菌益生菌，该大肠杆菌益生菌对猪肠道有益生作用，至今并未发现对宿主有已知的不益影响，并且申请人实验室对该猪源大肠杆菌益生菌通过全基因组测序，分析验证了其益生菌的基因背景。为了实现微生物中同源或异源蛋白或化合物的过量表达生产，大多利用质粒的过表达，这种方法易于操作和调控的表达而被广泛使用，但存在遗传不稳定性。质粒的复制，抗生素抗性基因，过量表达以及其他异源基因等问题所带来的代谢负担会导致宿主细胞耗尽，产量损失甚至导致宿主细胞原始功能丧失。此外，为了维持细菌细胞中质粒的存在，须使用抗生素或其他选择性药剂，这增加了整个生物加工的成本，同时也增加了耐药基因传播的几率。近年来，细菌染色体表达同源或异源基因在合成生物学和生物医学中越来越受青睐。在细菌染色体组整合同...
【技术保护点】
1.整合双拷贝功能性F4菌毛操纵子基因猪源益生菌EP1克隆株，其特征在于，该益生菌克隆株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018.7.2，保藏编号为CGMCC No.16048。
【技术特征摘要】
1.整合双拷贝功能性F4菌毛操纵子基因猪源益生菌EP1克隆株，其特征在于，该益生菌克隆株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018.7.2，保藏编号为CGMCCNo.16048。2.整合双拷贝功能性F4菌毛操纵子基因猪源益生菌EP1克隆株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：pTargetT-maeB::PtetF4和pTargetT-nth/tppB::PtetF4重组质粒的构建；通过整合双拷贝功能性F4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株的构建，得到无抗性的双拷贝F4菌毛基因整合克隆株。3.根据权利要求2所述的整合双拷贝功能性F4菌毛操纵子基因猪源益生菌EP1克隆株的构建方法，其特征在于，步骤2）具体为：pCas质粒电转化入益生菌EP1中以构建EP1/pCas重组菌株；制备EP1/pCas感受态，取EP1/pCas感受态细胞与pTargetT-maeB::PtetF4或pTargetT-nth/tppB::PtetF4重组质粒混合，对感受态细胞和pTargetT-maeB::PtetF4或pTargetT-nth/tppB::PtetF4重组质粒组成的混合物进行电转化，电击产物置于冰冻的LB培养基孵育，之后于30℃摇床复苏，涂布于含卡那霉素和壮观霉素的LB平板中于30°C培养过夜；挑取抗性平板上生长的疑似阳性克隆株病利用菌落PCR鉴定，若出现大于8000bp的条带，则证明整合成功，测序并确定是否获得了阳性双拷贝F4整合株；再去除抗性质粒，最终得到无抗性的双拷贝F4菌毛基因整合克隆株。4.根据权利要求2所述的整合双拷贝功能性F4菌毛操纵子基因猪源益生菌EP1克隆株的构建方法，其特征在于，去除抗性质粒的步骤为：将含有pCas和pTargetT-maeB::PtetF4或pTargetT-nth/tppB::PtetF4质粒的EP1菌株置于含卡那霉素和0.5mMIPTG的LB培养基中30℃摇床中培养14-18小时，之后挑取少许菌液于含卡那霉素的LB平板上划线，长出的双菌落于含壮观霉素的LB平板上划线以验证其对壮观霉素的敏感性，以验证是否去除了pTargetT-maeB::PtetF4或pTargetT-nth/tppB::PtetF4质粒；去除pTarge...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱国强，金铎，区炳明，夏芃芃，朱军，徐梦娴，宋浩亮，梁轩，杨颖，朱晓芳，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。