本发明专利技术公开了一株自溶链霉菌的基因工程菌株，该菌株是利用分子生物学手段敲除了自溶链霉菌中参与格尔德霉素生物合成的almM基因所构建的。该菌株通过发酵可大量产生具有很强抗肿瘤活性的化合物自溶霉素。采用本发明专利技术所提供的菌株进行发酵可大大提高自溶霉素的产量，用于生产自溶霉素比其它方法更加经济和环保。
【技术实现步骤摘要】
一株高产自溶霉素的自溶链霉菌
本专利技术属于微生物
，具体来说，涉及利用分子生物学方法构建链霉菌工程菌株，该工程菌可发酵产生大量自溶霉素。
技术介绍
以格尔德霉素（geldanamycin）为代表的苯醌安莎霉素类化合物（benzoquinoneansamycin）是目前研究最多、效果很好的抗肿瘤化合物之一。此类化合物的抗肿瘤机制是与肿瘤细胞中的热休克蛋白（heatshockprotein）Hsp90特异结合，导致肿瘤细胞内许多需要Hsp90维持功能的重要蛋白质迅速降解，从而抑制肿瘤细胞的生长或引发肿瘤细胞死亡。由于这类化合物对肿瘤细胞具有很高的特异性和极强的抗肿瘤活性，同时具有比传统的抗肿瘤药物更加广谱的抗肿瘤活性并且不容易产生抗药性，因此引起了人们的高度关注，成为近年来肿瘤治疗药物中的研究热点。目前，这类化合物中的17-AAG、17-DMAG及IPI-504等正由美国NCI主导的研究机构进行临床研究，有望成为新的抗肿瘤药物。自溶霉素（autolytimycin）是我们从放线菌新种自溶链霉菌（Streptomycesautolyticus）的次生代谢产物中发现的一个具有很强抗肿瘤活性的格尔德霉素结构类似物。自溶霉素与格尔德霉素以及目前正在美国进行临床研究的17-AAG和17-DMAG等其它结构类似物的主要区别在于其发色基团是苯酚而不是苯醌，这一结构差异使自溶霉素具有比格尔德霉素以及17-AAG更强的靶目标结合活性和更低的毒性。因此，自溶霉素具有良好的开发应用前景。然而，自溶霉素存在产率非常低的缺点，严重妨碍了对它的进一步研发，再加上自溶霉素的化学合成非常困难，所以有必要对其产生菌进行改良以提高自溶霉素产率。苯醌安莎霉素类化合物的生物合成是以3-氨基-5-羟基苯甲酸（3-amino-5-hydroxybenzoicacid，AHBA）为起始物，通过聚酮合酶（polyketidesynthase，PKS）逐步加入一些延伸元件如乙酸、丙酸和羟基乙酸等，形成一个聚酮的核心结构，最后再经过后修饰酶进行修饰而成。目前国内外对此类化合物的生物合成研究表明，其合成核心结构的PKS酶很相似，主要区别在于后修饰，即C-17位O-甲基化、C-21位氧化、C-7位甲氨酰化和C-4,5位氧化等，这些修饰对此类化合物的抗肿瘤活性及细胞毒性具有很重要的影响。我们克隆了自溶链霉菌格尔德霉素生物合成的全基因簇并进行了序列测序，通过生物信息学分析，选择了参与其生物合成的基因almM，对自溶链霉菌野生型菌株进行了遗传改造。该基因被敲除后，菌株能够产生大量的自溶霉素。本专利技术涉及的自溶霉素可以通过构建almM基因敲除工程菌大量发酵产生，与化学合成方法相比，更加经济、环保，并可持续利用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够大量产生自溶霉素的自溶链霉菌基因工程菌。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：1）采用Red/ET一步PCR法，以质粒pHY773为模板，通过PCR扩增获得两端带有与almM基因同源序列的aac(3)IV基因插入盒。2）通过电转化把所扩增片段导入含pIJ790和almM基因粘粒质粒的大肠杆菌（Escherichiacoli）中，筛选阿泊拉霉素（Apramycin）抗性的转化子获得含有插入突变的almM基因。3）从上述转化子中制备含有插入突变的almM基因的粘粒质粒，通过电转化导入大肠杆菌ET12567/pUZ8002中。4）利用接合转移把含有插入突变的almM基因导入野生型自溶链霉菌中，筛选阿泊拉霉素抗性和硫链丝菌素敏感的接合转移子。5）此突变株经Southern杂交验证为almM基因敲除的自溶链霉菌突变株。6）采用MS培养基培养获得自溶链霉菌almM基因突变株的新鲜孢子，接种新鲜孢子至TSB培养基中培养制备发酵种子液，然后接种种子液至发酵培养基中发酵培养。7）收集发酵液上清，用乙酸乙酯抽提两次。发酵产物经旋转蒸发仪45℃减压蒸干后溶于适量甲醇。采用HPLC对发酵产物进行分析。然后经正相硅胶柱层析及重结晶分离纯化发酵产物。8）所分离纯化的化合物结构经质谱和1H、13C核磁共振分析确认。本专利技术基因工程菌自溶链霉菌almM基因敲除突变株保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：武汉大学，保藏编号：CCTCCNO：M2013156，保藏日期：2013年4月24日。附图说明图1为自溶链霉菌almM基因敲除突变株的构建策略。图2为自溶链霉菌almM基因敲除突变株的Southern杂交验证。其中1为DNAMolecularWeightMarkerVII,DIGlabeled；2为BssHII酶切的野生型菌株基因组DNA；3为BssHII酶切的突变株基因组DNA。图3为自溶链霉菌almM基因敲除突变株的发酵产物检测。具体实施方式以下通过具体实施方式及实施例对本专利技术进行详细说明，但本专利技术的保护范围不限于此。实施例中所提到的制备、转化、接合转移、电泳和Southern杂交等过程，如无特殊说明，则采用本领域的常规方法均可实现，作为与本专利技术记载的并列方法不再赘述。实施例1：自溶链霉菌almM基因敲除突变株的构建：借助NCBI网站的ORFfinder、glimmer和BLAST等工具对所克隆并测序的格尔德霉素基因簇进行分析，推测各开放阅读框架（openreadingframe，ORF）功能。然后，采用Red/ET一步PCR法构建almM基因（SEQIDNO：1）的插入突变（图1）。在此方法中，首先以pHY773为模板，采用PCR扩增两端带有与almM基因同源序列的aac(3)IV基因插入盒。PCR扩增的引物为：5′-GTTCCAGGACACGGTCGATCTGATCCTGGCGGGCGAATGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3′（SEQIDNO：2）和5′-GAAGGGGACCAGTTCGTGTTCGGGTGGGGGAGTGCCTCATGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′（SEQIDNO：3），PCR扩增条件为：95℃预热5分钟，1个循环；94℃变性1分钟，50℃复性45秒，72℃扩增2.5分钟，10个循环；94℃变性1分钟，55℃复性45秒，72℃扩增1分钟，20个循环；72℃扩增5分钟；4℃1小时。然后通过电转化把PCR扩增片段导入含pIJ790和almM基因粘粒质粒的大肠杆菌中，筛选阿泊拉霉素抗性的转化子，获得含有插入突变的almM基因。从上述转化子中制备含有插入突变的almM基因的粘粒质粒，通过电转化导入大肠杆菌ET12567/pUZ8002中。利用接合转移把含有插入突变的almM基因导入野生型自溶链霉菌中，筛选阿泊拉霉素抗性和硫链丝菌素敏感的接合转移子，即可能的自溶链霉菌almM基因敲除突变株。采用Southern杂交验证自溶链霉菌almM敲除突变株（图2）。首先通过PCR扩增制备Southern杂交探针，PCR引物为：5′-GACCTGGTGTTCGAGCATGTGG-3′（SEQIDNO：4）和5′-GCCGATCAGCACGATCTTTCC-3′（SEQIDNO：5），PCR扩增条件为：95℃预热5分钟，1个循环；94℃变性1分钟，50℃复性45秒，72℃扩增2.5分钟，10个循环；9本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种自溶链霉菌，其特征在于：该菌为敲除了almM基因的自溶链霉菌（Streptomyces autolyticus），保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），中国武汉，保藏编号为CCTCC NO: M 2013156。
【技术特征摘要】
1.一种自溶链霉菌，其特征在于：该菌为敲除了almM基因的自溶链霉菌（Streptomycesautolyticus），保藏于中国典型培养物保藏中心（C...
【专利技术属性】
技术研发人员：鲁涛，韩秀林，纪开燕，尹敏，张呈波，
申请(专利权)人：云南大学，
类型：发明
国别省市：云南,53
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。