一株生产高分子量透明质酸的工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供一株生产高分子量透明质酸的工程菌及其构建方法和在产高分子量透明质酸中的应用，所述工程菌为枯草芽孢杆菌，拉丁文学名为Bacillus subtilis；命名为BH‑2菌株保藏编号CGMCC No.16841；该工程菌选用枯草芽孢杆菌WB600为基础菌种，向其基因组中引入了透明质酸合酶hasA基因，UDP‑葡糖脱氢酶hasB基因，UDP‑葡糖焦磷酸化酶hasC基因，维持了工程菌低蛋白酶活性的特点，并通过温度调控工程菌的生长代谢，获得了分子量为6.9×10

【技术实现步骤摘要】
一株生产高分子量透明质酸的工程菌及其构建方法和应用
本专利技术涉及一种透明质酸工程菌的构建方法、及其得到的工程菌，属于基因工程和微生物领域。
技术介绍
透明质酸(hyaluronicacid或hyaluronan,HA)是一种存在于软骨组织、关节液和皮肤组织的真皮以及表皮中的高分子糖胺聚糖，其市场需求与日俱增。透明质酸参与许多重要的生物学过程，可广泛应用于眼科学、整形手术和化妆品等领域。目前，工业上普遍采用弱化溶血性等毒性的C型链球菌来生产透明质酸。但由于其遗传不稳定性和复杂的处理手段，使得链球菌作为发酵菌种生产HA受到限制。随着合成生物学的发展，使得利用遗传背景清楚且是公认安全菌株(如枯草芽孢杆菌等)生产HA成为可能，另外，枯草芽孢杆菌含有除透明质酸合酶(hyaluronansynthase,HAS)外透明质酸合成途径的其他全部基因，因此枯草芽孢杆菌成为构建透明质酸重组菌株的首要选择。透明质酸生理功能与其分子量大小密切相关，不同分子量具有不同的功能，高分子量HA(Mr>2×106Da)具有较好的粘弹性，可广泛应用于眼科学、整形手术和伤口愈合等方面；中分子量HA(Mr:105～106Da)具有良好的保湿性和润滑性，可用于药物缓解作用；低分子量HA(Mr<104Da)可以抑制肿瘤扩散、促进骨和血管生成、免疫调节等作用，并且保湿性好，可用于临床医学、化妆品和滴眼液中的润滑剂等。有研究表明，心磷脂(cardiolipin)在细胞膜上的分布和数量在一定程度上会影响所合成的透明质酸的分子量。因此，可以通过改变心磷脂的分布和数量来改变透明质酸的分子量。目前缺乏一种工程菌，在改变某些培养条件(如温度等)下能分别产生高分子量和中分子量透明质酸，同时不会含有大量的蛋白酶和溶血素。
技术实现思路
本专利技术目的是克服现有技术存在的上述不足，提供一株生产高分子量透明质酸的工程菌及其构建方法和应用。为了解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一株生产高分子量透明质酸的工程菌，所述工程菌的建议分类命名为枯草芽孢杆菌，拉丁文学名为Bacillussubtilis；并命名为BH-2菌株；该菌株已于2018年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCCNo.16841。本专利技术同时提供了一种上述生产高分子量透明质酸的工程菌的构建方法，其中，包括以下步骤：第1、含透明质酸合成途径基因共表达的片段构建第1.1、从含乳房链球菌(Streptococcusuberis)透明质酸合酶基因hasA的合成菌株中提取基因组，利用PCR反应扩增hasA片段A，PCR引物对为hasABC-F1/hasABC-R1；从枯草芽孢杆菌WB600中提取基因组，并通过PCR方法扩增UDP-葡萄糖脱氢酶基因hasB序列片段B和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因hasC序列片段C，PCR引物对分别为hasABC-F2/hasABC-R2和hasABC-F3/hasABC-R3；第1.2、将PCR产物片段A、B和C进行重叠PCR，引物对为hasABC-F1/hasABC-R3，得到hasABC片段；第2、将第1步得到的hasABC片段与表达载体pHY300plk连接，经过原核感受态细胞导入，涂布LB+AmpR平板筛选，经过菌落PCR验证后获得连接正确的pHY300plk-hasABC质粒菌株；第3、将第2步中获得的pHY300plk-hasABC质粒电转化入枯草芽孢杆菌WB600中，涂布LB+TetR平板，筛选；挑取转化子，进行菌落PCR验证转化子，引物为hasABC-VF和hasABC-VR，挑取正确转化子，提取质粒，并进行酶切及PCR验证，即得透明质酸工程菌BH-2。WB600作为工程菌供体的特点：(1)非致病性：枯草芽孢杆菌对人畜无害。(2)细胞壁的组成简单，只含有肽聚糖和磷壁质，因此在分泌的蛋白质产品中不会混杂有胞被内毒素(热源性脂多糖)，而这一点是大肠杆菌无法比拟的。(3)没有明显的密码子偏爱性，同时表达产物也不容易形成包涵体：在E.coli表达系统中，若重组表达的外源蛋白质中含有大量连续的稀有密码子，则常常造成表达量低，或者翻译提前终止；而目标蛋白质产物形成包涵体会导致蛋白质不可溶，给分离纯化和回收目标蛋白质造成麻烦。而B.subtilis表达系统在这两个方面都不存在问题。(4)枯草芽孢杆菌WB600(上海GenemyBioTech公司)是在Bacillussubtilis168中敲除中性蛋白酶A基因、中性蛋白酶B基因、枯草溶菌素基因、胞外蛋白酶基因、金属蛋白酶基因和杆菌肽酶F基因等6个基因，其蛋白酶活性只是野生型菌株的0.32％，有利于外源蛋白的分泌与表达。本专利技术所述工程菌的具体构建过程中：第1.1步所述hasA基因为合成序列，序列见SEQIDNO：9，涉及引物为hasABC-F1和hasABC-R1，序列见SEQIDNO：1和SEQIDNO：2；所述hasB的GeneID:936766，涉及引物为hasABC-F2和hasABC-R2，序列见SEQIDNO：3和SEQIDNO：4，所述hasC的GeneID:936797，涉及引物为hasABC-F3和hasABC-R3，序列见SEQIDNO：5和SEQIDNO：6。PCR反应体系(50μl)：PCR反应条件：第1.2步所述将A,B和C进行重叠PCR，得到的hasABC片段的长度为5142bp，引物对为hasABC-F1/hasABC-R3。PCR反应体系(50μl)：PCR反应条件：第2步中，所述pHY300plk的载体特点：该载体为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体，即在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中都可以自主复制；含氨苄青霉素抗性AmpR和四环素抗性TetR，其中AmpR主要用于筛选大肠杆菌中的转化子，工作浓度为100ng/μl；TetR用于筛选枯草芽孢杆菌中的转化子，工作浓度为10ng/μl。酶切反应体系(50μl)：酶切反应温度为37℃，反应时间为2h。第3步中得到的酶切产物用纯化试剂盒(品牌：Tiangen，货号：DP204-02)纯化，得到纯化片段D和载体E，将二者进行连接反应，得到pHY300plk-hasABC。连接反应体系(10μl)：连接反应温度为16℃，过夜连接。第2步所述将得到的连接产物转化到感受态细胞DH5α(品牌：ZOMANBIO，货号：ZC101-1)，具体方法如下：1.将10μl连接体系加入到50μlDH5α感受态，轻弹使其混匀，冰浴30min；2.42℃热激90s，立即冰浴2min；3.加500μlLB，放入37℃摇床，110rpm复苏45min；4.将复苏后的大肠杆菌离心5000rpm，2min收集菌体；5.弃上清，留取200μl重悬菌体，涂布LB+AmpR平板，37℃培养。6.待转化子长出，挑单菌落于LB+AmpR中培养。然后进行菌落PCR验证，涉及引物为hasABC-VF和hasABC-VR，序列见SEQIDNO：7和SEQIDNO：8，PCR产物大小为1736bp)。LB培养基为分子克隆常用基础培养基(分为固态培养基和液体培养基，详见分子克隆实验指南，第四版，冷泉港实验室)。菌落PCR反应体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株生产高分子量透明质酸的工程菌，其特征在于，所述工程菌为枯草芽孢杆菌，拉丁文学名为Bacillus subtilis；命名为BH‑2菌株；已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号CGMCC No.16841。

【技术特征摘要】
1.一株生产高分子量透明质酸的工程菌，其特征在于，所述工程菌为枯草芽孢杆菌，拉丁文学名为Bacillussubtilis；命名为BH-2菌株；已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号CGMCCNo.16841。2.一种权利要求1所述产高分子量透明质酸工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：第1、含透明质酸合酶基因的片段构建第1.1、从含乳房链球菌(Streptococcusuberis)透明质酸合酶基因hasA的合成菌株中提取基因组，利用PCR反应扩增hasA片段A，从枯草芽孢杆菌WB600中提取基因组，利用PCR反应扩增hasB片段B和hasC片段C，PCR引物对分别为hasABC-F1/hasABC-R1，hasABC-F2/hasABC-R2和hasABC-F3/hasABC-R3；第1.2、将扩增片段A、B和C进行重叠PCR，重叠PCR引物为hasABC-F1/hasABC-R3，获得hasABC片段；第2、将第1步获得的hasABC片段与表达载体pHY300plk连接，经过原核感受态细胞导入，涂布平板LB+AmpR平板，筛选，经过菌落PCR验证后获得连接正确的pHY300plk-hasABC质粒菌株；第3、将第2步中获得的pHY300plk-hasABC质粒电转化入枯草芽孢杆菌WB600中，涂布LB+TetR平板，筛选；挑取转化子，菌落PCR验证转化子，引物为hasABC-VF和hasABC-VR，挑取正确转化子，提取质粒，并酶切及PCR验证，即得透明质酸工程菌BH-2。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述hasA涉及引物为hasABC-F1ACGCGTCGACTATCACCGCCCAGCCTAAhasABC-R1GATCTTCCAATTTATAATGGTCGCAGTGTCGGTACC。4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述hasB的GeneID:936766，涉及引物为hasABC-F2GGTACCGACACTGCGACCATTATAAATTGGAAGATChasABC-R2TGATCGAAAAATCTAGACAGCTTCAACCAAGTAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：马挺，李国强，李莹莹，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津,12