用于有效活化NKT细胞的技术制造技术

本发明专利技术涉及用于活化NKT细胞并由此增殖所述NKT细胞、产生IFN‑γ和/或产生能够强烈地诱导细胞毒活性的NKT细胞配体‑脉冲的人CD14阳性细胞的方法。更具体地，该方法的特征在于包括将分离的CD14阳性细胞在含有NKT细胞配体和GM‑CSF但基本上不含IL‑4的培养基中培养。此外，本发明专利技术涉及用于产生NKT细胞配体‑脉冲的人CD14阳性细胞系的方法。更具体地，该方法的特征在于包括将分离的CD14阳性细胞在含有NKT细胞配体但基本上不含GM‑CSF和IL‑4的培养基中培养。此外，本发明专利技术涉及含有NKT细胞配体‑脉冲的人CD14阳性细胞或NKT细胞配体‑脉冲的人CD14阳性细胞系的细胞制备物及其药物用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于有效活化NKT细胞的技术[
]本专利技术涉及用于有效活化NKT细胞的技术。更具体地，本专利技术涉及用于产生具有优异NKT细胞活化活性的NKT细胞配体-脉冲的(pulsed)细胞的方法，通过所述方法获得的细胞，所述细胞的药物用途等。[
技术介绍
]自然杀伤(下文NK)T细胞是属于新型淋巴细胞谱系且显示与其它淋巴细胞谱系(T、B、NK细胞)的特征不同的特征的免疫细胞。NKT细胞与NK细胞有关，因为NKT细胞中存在细胞毒性的穿孔蛋白颗粒(非专利文献1)。然而，由于NKT细胞不仅表达NK细胞标志物而且表达T细胞受体(TCR)，因此其为明显不同的新细胞群(非专利文献2)。NKT细胞具有产生Th-1型细胞因子(主要是IFN-γ)和Th-2型细胞因子(主要是IL-4)两者的能力(非专利文献3)，且因此表明NKT细胞可能在平衡免疫系统方面发挥作用(非专利文献4)。因此，如果可以控制NKT细胞的作用，可以治疗由免疫系统的平衡异常引起的各种疾病、特别是癌症和感染性疾病。NKT细胞的最显著的特性是NKT细胞中表达的TCR的α链在一个物种的所有个体中是相同的。这表明同种异体生物体中的所有NKT细胞都通过识别相同的物质而被活化。该α链在人体中是Vα24，且在小鼠中是Vα14，并且其在两个物种之间具有非常高的同源性。此外，已知仅非常有限种类的β链与α链配对。因此，该TCR也称为“不变型TCR”。其特征还在于NKT细胞的TCR识别糖脂，而一般T细胞的TCR识别蛋白片段。α-半乳糖苷神经酰胺(α-GalCer)是从毛里求斯群海绵(Agelasmauritianus,其是一种海洋海绵)的提取物分离的糖脂，并且被报道为强烈地活化NKT细胞(非专利文献5)。α-半乳糖苷神经酰胺由以树突细胞(DC)等代表的抗原递呈细胞(APC)摄取，且然后由与主要组织相容性复合体(MHC)I类分子类似的CD1d蛋白递呈在细胞膜上。由于在物种中仅存在一种该CD1d分子并且其对所有人都是共有的，所以α-GalCer成为所有人共有的药物。通过使用NKT细胞中唯一的TCRα链识别因此呈递的CD1d蛋白和α-半乳糖苷神经酰胺的复合物来活化NKT细胞，并起始各种免疫反应。近年来，已经注意到如上所述的NKT细胞的功能，并且已经开发了含有α-GalCer作为活性成分的癌症的治疗药物。然而，通过施用α-GalCer活化的NKT细胞同时产生IFN-γ(刺激细胞介导的免疫且可用于治疗癌症和感染性疾病的细胞因子)和IL-4，其对于细胞免疫是抑制性的。作为结果，两者的功能相互抵消，导致可能指出对癌症和感染性疾病的治疗的效果可能并不总是足够的。因此，已经开发了许多α-GalCer衍生物，其强烈地活化NKT细胞并优先于IL-4产生IFN-γ(专利文献1-5)。由α-GalCer活化的NKT细胞通过表达各种杀细胞诱导剂诸如穿孔蛋白等直接显示针对靶细胞的细胞毒活性(非专利文献1、6)。它们是非常独特的细胞，因为它们表现出通过由活化的NKT细胞迅速且大量产生的Th1-型细胞因子诸如干扰素-γ等、树突细胞(DC)的成熟等，对NK细胞和CD8+T细胞的细胞毒活性的增强作用(非专利文献7)。此外，在小鼠癌症转移模型中揭示，通过细胞疗法发挥更有效的抗肿瘤作用，在所述细胞疗法中，经由通过树突细胞(DC)呈递施用α-GalCer，而不是单独施用α-GalCer(非专利文献8)。基于这些研究，已经进行了靶向NKT细胞的免疫细胞疗法的临床开发，其中施用用NKT细胞配体诸如α-GalCer等脉冲的DC以在体内活化NKT细胞并且其抗肿瘤作用被用于治疗和预防癌症和感染性疾病。例如，非专利文献9已经报道，在用于非小细胞肺癌的α-GalCer-脉冲的DC治疗中，通过施用α-GalCer-脉冲的DC增加外周血细胞中产生IFN-γ的细胞的一组病例与非增加病例组相比显示总体存活期的显著延长。尽管α-GalCer反应性的产生IFN-γ的细胞通常是NKT细胞，但已经发现在施用α-GalCer-脉冲的DC后NK细胞增加(非专利文献10、11)，并且表明通过α-GalCer-脉冲的DC疗法活化的NKT细胞对其他免疫细胞的佐剂作用。鉴于产生IFN-γ的细胞的增加和存活期延长作用之间的密切关系，如何增强IFN-γ产生被认为对于改善通过使用用NKT细胞配体诸如α-GalCer等脉冲的抗原呈递细胞的免疫细胞疗法来治疗和预防癌症和感染性疾病的结果是重要的。在非专利文献9中的α-GalCer-脉冲的DC疗法中，通过将通过组分血液采样从患者收集的所有外周血细胞在GM-CSF和IL-2存在的情况下培养1至2周来获得树突细胞。此外，在施用于患者前一天，将树突细胞用α-GalCer脉冲，培养1天，并通过滴注静脉内施用获得的α-GalCer-脉冲的DC。在该培养系统中，单核细胞来源的DC的成熟由于培养细胞中含有的T细胞产生的IL-4、TNF-α而进行，并且α-GalCer的呈递能力得到增强。通常，通过将单核细胞在GM-CSF和IL-4存在的情况下在外周血中培养约6天来获得未成熟树突细胞，将未成熟树突细胞与炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)一起培养约2天以产生成熟的树突细胞，并将成熟的树突细胞用NKT细胞配体诸如α-GalCer等脉冲，由此活化NKT细胞(非专利文献5、12)。如上所述，成熟树突细胞专门用作NKT细胞的抗原呈递细胞，并且单核细胞和未成熟树突细胞被认为不能适当地将抗原呈递至NKT细胞并有效地活化NKT细胞。另一方面，成熟树突细胞的制备需要长期培养。[文献列表][专利文献]专利文献1：WO2008/102888A1专利文献2：WO2009/119692A1专利文献3：WO2010/030012A1专利文献4：WO2011/552842A1专利文献5：WO2013/162016A1[非专利文献]非专利文件1：Proc.Natl.Acad.Sci.USA1998,95,5690-5693非专利文件2：J.Immunol.1995,155,2972-2983非专利文件3：J.Immunol.1998,161,3271-3281非专利文件4：Science,1997,278,1623-1626非专利文件5：Science,1997,278,1626-1629非专利文件6：CancerRes1999;59:5102-5105非专利文件7：NatImmunol2003;4:1164-1165非专利文件8：JImmunol1999;163:2387-2391非专利文件9：JImmunol2009;182:2492-2501非专利文件10：ClinCancerRes2006;12:6079-6086非专利文件11：CancerSci2008;99:638-645.非专利文件12：NatImmunol,2002,3(9):867-874。[专利技术概述][本专利技术待解决的问题]本专利技术的一个目的是提供用于在相对短时段内产生具有强NKT细胞活化能力的NKT细胞配体-脉冲的细胞的技术。[解决问题的方式]本专利技术人已经进行了深入研究以试图解决前述问题。作为结果，他们扭转了“树突细胞的抗原呈递和由此T细胞活化”的常识，并且发现，当NKT细胞被活化时，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于产生NKT细胞配体‑脉冲的人CD14阳性细胞的方法，其包括在含有NKT细胞配体和GM‑CSF且基本上不含IL‑4的培养基中培养分离的CD14阳性细胞的步骤，或用于产生NKT细胞配体‑脉冲的人CD14阳性细胞系的方法，其包括在含有NKT细胞配体且基本上不含GM‑CSF和IL‑4的培养基中培养分离的CD14阳性细胞系的步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.28 JP 2016-0916741.用于产生NKT细胞配体-脉冲的人CD14阳性细胞的方法，其包括在含有NKT细胞配体和GM-CSF且基本上不含IL-4的培养基中培养分离的CD14阳性细胞的步骤，或用于产生NKT细胞配体-脉冲的人CD14阳性细胞系的方法，其包括在含有NKT细胞配体且基本上不含GM-CSF和IL-4的培养基中培养分离的CD14阳性细胞系的步骤。2.用于产生NKT细胞配体-脉冲的人CD14阳性细胞系的方法，其包括在含有NKT细胞配体且基本上不含GM-CSF和IL-4的培养基中培养分离的CD14阳性细胞系的步骤。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述培养基基本上不含SCF和/或Flt3L。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中分离的CD14阳性细胞具有不小于70％的纯度。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中将所述细胞在添加所述NKT细胞配体后培养至少16小时。6.根据权利要求5所述的方法，其中将所述细胞在添加所述NKT细胞配体后培养16-72小时。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述NKT细胞配体是由下式(VI)代表的化合物，或其盐：其中X是...

【专利技术属性】
技术研发人员：谷口克，重浦智邦，相原美菜子，花田敬吾，
申请(专利权)人：国立研究开发法人理化学研究所，株式会社安必思恩，
类型：发明
国别省市：日本,JP