从多能干细胞分化巨噬细胞制造技术

本发明专利技术涉及一种从干细胞培养类原始巨噬细胞的方法，用于该方法中的试剂盒，和类原始巨噬细胞用于体外疾病模型和用于筛选供治疗用的化合物的用途。一种实施的培养方法包括将胚胎干细胞或诱导性多能干细胞与包括GSK3抑制剂的无血清培养基接触并孵育以使干细胞分化成中胚层谱系的细胞，随后用包括Dickkopf相关蛋白1(DKK1)的培养基孵育以使中胚层分化成造血谱系的细胞，使造血细胞成熟，和将这些细胞用包括M‑CSF的培养基孵育以促使分化成类原始巨噬细胞。另一个实施方案包括将干细胞用包括FGF2和BMP4的无血清培养基孵育以诱导分化成中胚层谱系的细胞，随后将细胞用包括FGF2、BMP4、激活素A(Activin A)和VEGF的培养基孵育以使中胚层谱系的细胞分化成造血细胞谱系的细胞，使造血细胞谱系的细胞成熟，最后将成熟造血细胞用包括M‑CSF的培养基孵育以促使造血细胞分化成类原始巨噬细胞。

Differentiation of macrophages from pluripotent stem cells

The invention relates to a method for stem cell culture from original macrophages, a kit for the method, and the type of primitive macrophages for in vitro models of disease and use for screening compounds for the treatment of. An implementation of the training methods include the serum-free medium and incubated in contact to make stem cells to differentiate into mesodermal lineage cells and embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells including GSK3 inhibitors, followed by Dickkopf related protein 1 (DKK1) of the incubated to make mesoderm differentiation into hematopoietic lineages. The mature cells, hematopoietic cells, and the cells with medium for including M with CSF to induce differentiation into original macrophages. Another embodiment comprises a dry serum-free incubation to differentiate into mesodermal cell lineages by cells including FGF2 and BMP4, then the cells including FGF2, BMP4, activin A (Activin A) and VEGF medium for education to make the mesodermal lineage cells into hematopoietic cell lineages. The cell, the cell maturation of hematopoietic cell lineages, finally mature hematopoietic cells in culture medium were including M with CSF to promote hematopoietic differentiation into primitive macrophages.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从多能干细胞分化巨噬细胞相关申请的交叉引用本申请要求2015年1月16日提交的新加坡申请第10201500366V号的优先权，其内容以引用的方式全部并入本文中以用于所有目的。
本专利技术涉及从干细胞分化巨噬细胞。具体来说，本专利技术涉及一种用于从干细胞分化原始巨噬细胞的无血清、无饲养层细胞且无胚状体的方法。
技术介绍
巨噬细胞是单核吞噬细胞，其在体内稳态和免疫力中起关键作用，但也造成广泛范围的病理且因此代表关键的治疗标靶。然而，在对于从人多能干细胞分化原始巨噬细胞的深入研究中，其体内稳态以及其在组织特异性情形中的指定活性目前是缺乏的。根据单核吞噬细胞系统(MPS)概念，组织常驻型巨噬细胞的稳态依赖于血液单核细胞的恒定募集。然而，虽然单核细胞在病理环境和炎症中明确产生巨噬细胞，但是最新证据显示(1)单核细胞在稳态下和在某些类型的炎症中并不显著产生特定的组织巨噬细胞，和(2)一些成人组织巨噬细胞例如脑小胶质细胞是衍生自被称作原始巨噬细胞的胚胎原始前体，其在出生前就植根在组织中并且通过自我更新在成人体内自我维持。基于这个证据，需要对体外巨噬细胞的胚胎原始起源进行重述以便设计出靶向单核细胞和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于从干细胞培养类原始巨噬细胞的方法，其中所述方法包括：(a)将所述干细胞与包括GSK3抑制剂的无血清培养基接触并孵育以诱导所述干细胞分化成中胚层谱系的细胞；(b)将所述中胚层谱系的细胞与包括DKK1的培养基接触并孵育以使所述中胚层谱系的细胞分化成造血细胞谱系的细胞；(c)使所述造血细胞谱系的细胞成熟；(d)将所述造血细胞谱系的成熟细胞与包括M‑CSF的培养基接触并孵育以促使所述造血细胞分化成类原始巨噬细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.01.16 SG 10201500366V1.一种用于从干细胞培养类原始巨噬细胞的方法，其中所述方法包括：(a)将所述干细胞与包括GSK3抑制剂的无血清培养基接触并孵育以诱导所述干细胞分化成中胚层谱系的细胞；(b)将所述中胚层谱系的细胞与包括DKK1的培养基接触并孵育以使所述中胚层谱系的细胞分化成造血细胞谱系的细胞；(c)使所述造血细胞谱系的细胞成熟；(d)将所述造血细胞谱系的成熟细胞与包括M-CSF的培养基接触并孵育以促使所述造血细胞分化成类原始巨噬细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述干细胞选自胚胎干细胞(ESC)和诱导性多能干细胞(iPSC)。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述干细胞是人H1胚胎干细胞(ESC)。4.根据权利要求2所述的方法，其中所述干细胞是人诱导性多能干细胞(iPSC)。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述GSK3抑制剂是6-溴靛玉红-3′-肟(BIO)、CHIR-99021、SB216763、CHIR-98014、TWS119、IM-12、1-氮杂坎帕罗酮、AR-A014418、SB415286、AZD1080、AZD2858、靛玉红、A1070722、TCS2002、Tideglusib或其任何衍生物。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中在权利要求1的步骤(a)之前的至少24小时，将所述干细胞以小于1个小集落/cm2的密度接种到涂布有Matrigel的6孔板上。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中在权利要求1的步骤(a)之前用包括80％DMEM/F12、20％KnockOut血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巯基乙醇和FGF-2的培养基孵育所述干细胞。8.根据权利要求7所述的方法，其中在所述培养基中孵育所述干细胞约1天。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中在权利要求1的步骤(a)中将所述干细胞与包括1-20ng/ml的BMP4、5-100ng/ml的VEGF、0-50ng/ml的FGF-2和0-10μM的CHIR99021的分化培养基接触。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述分化培养基是获自Invitrogen的11.根据权利要求9或10所述的方法，其中在约5％的氧浓度下用所述培养基孵育所述细胞约2天。12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中所述细胞另外与1-20ng/ml的BMP4和5-100ng/ml的VEGF接触。13.根据权利要求12所述的方法，其中在约5％的氧浓度下用所述培养基孵育所述细胞约2天。14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中在权利要求1的步骤(b)中将所述细胞与包括5-100ng/ml的VEGF、0-50ng/ml的FGF-2、0-250ng/ml的SCF、0-500ng/mlDKK1、0-50ng/ml的IL-6和0-50ng/ml的IL-3的分化培养基接触。15.根据权利要求13所述的方法，其中在约5％的氧浓度下用所述培养基孵育所述细胞约3天。16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中在权利要求1的步骤(c)中，所述细胞通过与包...

【专利技术属性】
技术研发人员：林慧盈，T·胡贝尔，佛罗伦特·吉恩欧克斯，
申请(专利权)人：新加坡科技研究局，
类型：发明
国别省市：新加坡,SG