本发明专利技术公开了PDL1‑IgGFc融合蛋白抑制重症疟疾发病的应用，属于抗疟疾药物制备技术领域。本发明专利技术构建PDL1分子胞外段和IgG分子Fc片段的融合基因，将此融合基因构建入腺病毒或在体外进行表达，通过Western Blot方法验证该融合蛋白表达成功。在体外细胞实验中，该融合蛋白能够显著抑制ConA诱导的CD8+T细胞活化，同时在小鼠体内试验中，尾静脉注射表达PDL1‑IgGFc融合蛋白的重组腺病毒能够明显缓解伯氏疟原虫安卡株感染导致的脑型疟的发生，延长小鼠的生存时间。本发明专利技术表明PDL1‑IgGFc融合蛋白具有抑制重症疟疾发生的作用，而这种抑制作用与其能够抑制CD8+T细胞的活化有关。该融合蛋白为临床上治疗脑型疟等重症疟疾提供了新的药物选择。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于抗疟疾药物制备
，具体涉及PDL1-IgGFc融合蛋白抑制重症疟疾的应用。
技术介绍
疟疾是世界上流行最严重的感染性疾病之一，全球有32亿人受其威胁，2014年全球疟疾病例数约为2.14亿人，死亡44万人。感染人的疟原虫主要有5种，重症疟疾通常由恶性疟原虫引起，其中，脑型疟是最严重的重症疟疾之一，有研究指出，即便经过积极治疗其死亡率仍可高达18％，大多数儿童脑型疟患者在中枢神经系统症状发作后的1-2天内死亡，即便是幸存病例也往往会遗留神经系统后遗症。大部分研究认为，脑型疟由感染疟原虫的红细胞黏附脑血管引发，继之而起的脑组织局部微循环障碍和免疫病理损伤协同造成血脑屏障破坏是脑型疟最主要的病理变化特点。但截至目前，脑型疟发生血脑屏障损伤的具体机制仍未完全阐明。现有大量研究表明：活化的脑血管内皮细胞摄取的疟原虫成分可与MHC I类分子结合，并交叉提呈给CD8+T细胞，疟原虫特异性CD8+T细胞(CTL细胞)靶向杀伤这些提呈疟原虫抗原的内皮细胞，造成血脑屏障损伤以及后续的出血、脑水肿等病理变化。因此，可以推测：如能以适当途径下调疟原虫感染时CD8+CTL细胞的活化程度，就有可能减轻血脑屏障损伤程度，从而降低脑型疟的发生率和死亡率。程序性死亡受体-1(Programmed cell death-1,PD-1)是活化的T细胞表面表达的重要的负调节共刺激分子，与PD-1配体结合，转导T细胞抑制信号，可抑制T细胞增殖和活性，有利于维持机体免疫自身稳定，从而防止过度的免疫损伤和自身免疫病的发生。PD-1配体有PDL1和PDL2两种。近年来 PD-1/PD-L通路研究在抗肿瘤、抗自身免疫病等领域取得的突破性进展给脑型疟免疫治疗带来新的启示。在非脑型疟模型中的研究表明，PD-1表达导致效应性T细胞衰竭，如果阻断PD-1/PD-L通路，则T细胞应答水平进一步提高，更有利于宿主清除疟原虫。同时，根据本课题组前期的研究，在脑型疟模型中，如果阻断PD-1/PDL通路，则小鼠脑型疟症状会因为T细胞应答水平进一步提高而加重，生存时间缩短，因此本课题组提出，在脑型疟模型中，如人为提高PD-1/PDL通路信号，抑制CD8+T细胞过度活化，则有望缓解脑型疟症状，从而为临床治疗脑型疟等重症疟疾提供新的治疗方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种PDL1-IgGFc融合蛋白抑制重症疟疾发病的应用。本专利技术是通过以下技术方案来实现：本专利技术公开了PDL1-IgGFc融合蛋白在制备治疗重症疟疾的药物中的应用。所述的药物为抑制T细胞过度活化的药物。所述药物的作用靶点为表达于活化T细胞表面的PD-1分子。所述的药物为通过PD-1/PD-L途径抑制CD8+T细胞过度活化的药物。所述的药物为抑制脑型疟疾的药物。所述PDL1-IgGFc融合蛋白是由PDL1分子胞外段和IgG分子Fc片段组成的融合蛋白。编码PDL1-IgGFc融合蛋白的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。PDL1-IgGFc融合蛋白的细胞给药量为1μg/ml～100μg/ml。PDL1-IgGFc融合蛋白的动物给药量为1～100mg/kg。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果：本专利技术提供的通过分子生物学的方法，构建PDL1分子胞外段和IgG分子Fc片段的融合基因，将此融合基因构建入腺病毒或在体外进行表达，通过qPCR和Western Blot方法验证该融合蛋白表达成功。在体外细胞实验中，该融合蛋白能够显著抑制ConA诱导的CD8+T细胞活化，同时在小鼠体内试验中，尾静脉注射表达PDL1-IgG1Fc融合蛋白的重组腺病毒能够明显缓解伯氏疟原虫安卡株感染导致的脑型疟的发生，延长小鼠的生存时间。因此，本专利技术表明PDL1-IgGFc融合蛋白具有抑制重症疟疾发生的作用，而这种抑制作用与其能够抑制CD8+T细胞的活化有关。该融合蛋白为临床上治疗脑型疟等重症疟疾提供了新的药物选择。附图说明图1为克隆小鼠PDL1胞外段和IgG1Fc段基因结果图；其中，(a)为PDL1胞外段PCR结果，(b)为IgG1Fc片段PCR结果；图2为pIRES2-EGFP质粒图谱；图3为IgG1Fc-pIRES2构建结果，EcoR I和Sac II双酶切鉴定结果，小片段为IgG1Fc；图4为PDL1-IgG1Fc-pIRES2构建结果；其中，(a)为Bgl II和EcoR I双酶切鉴定结果，小片段为PDL1；(b)为构建成功的质粒示意图；图5为PDL1-IgG1Fc-pIRES2转染293细胞，显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达结果；图6为重组腺病毒构建原理示意图；图7为PCR验证PDL1-IgG1Fc/IgG1Fc-PMT85穿梭质粒载体结果；其中，(a)为PCR验证PDL1-IgG1Fc；(b)为PCR验证IgG1Fc；图8为PDL1-IgG1Fc/IgG1Fc-PMT85穿梭质粒载体图谱；其中，(a)为PDL1-IgG1Fc-PMT85；(b)为IgG1Fc-PMT85；图9为重组腺病毒感染HEK293细胞；图10为Western Blot检测目的蛋白表达；图11为体外表达目的蛋白Western Blot检测结果；图12为PDL1-IgG1Fc抑制脾脏细胞增殖结果；其中，(a)为ConA刺激脾脏细胞增殖，细胞数量1×106细胞/孔，刺激72小时；(b)为PDL1-IgG1Fc抑制脾脏细胞增殖结果；图13为PDL1-IgG1Fc抑制CD8+T细胞增殖结果；其中，(a)为ConA浓度为2μg/ml，刺激72小时；(b)PDL1-IgG1Fc抑制CD8+T细胞增殖结果；图14为PDL1-IgG1Fc重组腺病毒体内实验结果。具体实施方式下面结合具体的实施例对本专利技术做进一步的详细说明，所述是对本专利技术的解释而不是限定。本专利技术在PD-1基因敲除脑型疟小鼠模型中的预实验结果证明了：PD-1/PD-L通路调控对脑型疟转归具有明显影响，这就使得通过适当上调PD-1/PD-L通路从而减轻脑型疟等重症疟疾症状的免疫治疗策略成为可能。本专利技术基于以上研究结果提出如下假设：如果在小鼠脑型疟模型中，能够让血管内皮细胞特异性过表达PD-L配体，则CD8+CTL细胞就会从内皮细胞接受更多的PD-L信号，其表面就会有更多的PD-1受体被活化，从而向细胞内转导更多的抑制信号，进一步下调CD8+CTL细胞的活化程度，最终减轻内皮细胞和血脑屏障的损伤程度，降低脑型疟的发生率和死亡率。本专利技术构建了一种PDL1-IgG1Fc融合蛋白，该融合蛋白通过抑制机体过度的免疫反应从而达到抑制脑型疟发生的作用，从而为临床上治疗脑型疟等重症疟疾提供新的方法。1、PDL1-IgG1Fc融合基因的构建1.1 获取小鼠PDL1胞外段和IgG1Fc段基因1.1.1 设计引物根据NCBI资料，设计扩增PDL1胞外段和IgG1Fc段基因的引物，同时为顺利插入pIRES2-EGFP载体，加入合适的限制性内切酶酶切位点，此外，由于IgG1Fc分子的铰链区存在4个半胱氨酸，会形成二硫键，因此采用点突变的方法，将半胱氨酸突变为丝氨酸。PDL1F：CAG AGA TCT ATG AGG ATA TTT GCT GGC ATT(黑色下划线为Bgl本文档来自技高网...
【技术保护点】
PDL1‑IgGFc融合蛋白在制备治疗重症疟疾的药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.PDL1-IgGFc融合蛋白在制备治疗重症疟疾的药物中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物为抑制T细胞过度活化的药物。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物的作用靶点为表达于活化T细胞表面的PD-1分子。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的药物为通过PD-1/PD-L途径抑制CD8+T细胞过度活化的药物。5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物为抑制脑型疟疾的药物。6.如权利要求1所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵亚，王军，沈燕，李英辉，梁姣，黄豫晓，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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