人源化抗claudin-1抗体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及人源化抗claudin‑1抗体及其用途。丙肝病毒感染是慢性肝病的主要原因，也是肝移植的主要指征。紧密连接蛋白claudin‑1(CLDN1)是HCV的必需入选因子，并且是治疗的有希望的靶标。对于临床开发，本发明专利技术人已经将通过遗传免疫产生的大鼠抗CLDN1抗体人源化，所述大鼠抗CLDN1抗体预防HCV感染并且还治愈慢性感染的人肝嵌合小鼠。重要人源化抗CLDN1抗体(H3L3)泛基因型地抑制原代人肝细胞(PHH)的HCV假颗粒感染而没有可检测的逃逸。H3L3有效抑制多种HCV基因型3菌株的感染，并与直接作用抗病毒药物(DAA)显示出显著的协同作用。本发明专利技术人还证明，抗CLDN1 H3L3在单一疗法中治愈人肝嵌合uPA‑SCID小鼠中的持久性HCV感染。因此，本发明专利技术涉及人源化抗claudin‑1抗体及其用途，特别是用于预防和治疗丙肝病毒感染、病毒诱导的肝病、肝细胞癌(HCC)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪肝炎(NASH)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人源化抗claudin-1抗体及其用途
本专利技术涉及人源化抗claudin-1抗体及其用途，尤其用于预防和治疗丙肝病毒感染、病毒相关性肝病与肝细胞癌。
技术介绍
慢性丙肝病毒(HCV)感染是全世界肝硬化和肝细胞癌(HCC)的主要原因。虽然最近批准的新型直接作用抗病毒药物(DAA)已经彻底改变了HCV治疗，但并非所有患者群体都对治疗有反应。特别是，基因型3HCV对DAA的反应很差，并且与脂肪变性相关且快速进展为晚期肝病(1)。选择DAA抗性HCV变体也可以引起治疗失败，因为当前DAA的靶标由高度可变的病毒基因组编码。DAA预防肝移植再感染的能力仍有待确定(4)。此外，DAA的极高成本阻碍了大多数患者获得治疗，特别是在发展中国家，但也在高资源环境中。宿主靶向剂(HTA)为抗病毒疗法提供了有吸引力的补充方法。在这种情况下，HCV的进入(一个复杂且高度协调的过程)提供了许多抗病毒靶标，具有HTA阻断进入可以预防肝移植再感染这一明显优势。此外，由于这些分子的靶标由宿主细胞基因组编码，因此对抗性具有更高的遗传屏障。HCV需要几种宿主因子来建立感染，包括分化簇81(CD81)(5)、清除剂受体BI(SR-BI)(6)、claudin-1(CLDN1)(7)、occludin(8)、受体酪氨酸激酶(9)、Niemann-PickC1样1(NPC1L1)(10)、Harvey大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(HRas)(11)和转铁蛋白受体1(12)。由于这些宿主因子对于HCV进入是必需的并且有助于持久性，因此它们也是开发广谱且有效的抗HCV剂的有吸引力的靶标。实际上，已经表明靶向CD81(13-16)、SR-B1(17-19)和CLDN1(20,21)的抗体在体外和体内有效地且泛基因型地抑制HCV感染，以及靶向EGFR(9)、NPC1L1(10)和HRas(11)的小分子同样表现出抗HCV活性。重要的是，HTA与DAA协同作用(22)，并已被证明可以防止出现DAA抗性变体(23)，这对于联合治疗用途是有吸引力的特征。专利技术人先前报道了使用HCV假颗粒(HCVpp)和细胞培养物衍生的HCV(HCVcc)模型系统，用肝癌细胞和原代人肝细胞(PHH)制备了在体外具有强大抗HCV活性的大鼠抗CLDN1单克隆抗体(mAb)(20、24和WO2010034812)。这些抗体通过破坏CD81-CLDN1共受体复合物的形成来抑制HCV进入。此外，他们最近报道在人肝嵌合uPASCID小鼠中，最重要的大鼠抗CLDN1单克隆抗体(OM-7D3-B3)预防新生HCV感染并清除慢性HCV感染，而不会诱导任何毒性(21)。鉴于这些最有希望的发现，该抗体的人源化是其临床开发的下一步。专利技术简述本专利技术涉及人源化抗claudin-1抗体及其用途，尤其用于治疗丙肝病毒感染。具体地，本专利技术由权利要求所限定。专利技术详述丙肝病毒感染是慢性肝病的主要原因，也是肝移植的主要指征。虽然直接作用抗病毒药物(DAA)可有效治愈慢性HCV感染，但治疗失败的患者仍需要替代策略。此外，DAA预防肝移植再感染的能力仍在临床研究中。由于其泛基因型效应和对抗性的高遗传屏障，宿主靶向剂是DAA的有力替代物。紧密连接蛋白claudin-1(CLDN1)是HCV必需的进入因子，并且是治疗的有希望的靶标。本专利技术人最近描述了通过遗传免疫产生的大鼠抗CLDN1抗体，其不仅可以预防HCV感染，还可以治愈慢性感染的人肝嵌合小鼠。为了进一步进行其临床开发，专利技术人现已将这种抗体人源化。最重要的人源化抗CLDN1抗体(H3L3)泛基因型地抑制了原代人肝细胞(PHH)的HCV假颗粒感染而没有可检测的逃逸，可能是由于PHH中其他claudin亚型的表达水平低。H3L3有效抑制了多种HCV基因型3菌株的感染，并显示出与DAA的显著协同作用。最后，专利技术人证明抗CLDN1H3L3在单一疗法中治愈了人肝嵌合uPA-SCID小鼠中的持久性HCV感染。该研究为旨在进一步开发抗CLDN1抗体用于预防和治愈HCV感染的临床前和临床研究铺平了道路。因此，本专利技术的第一个方面提供抗claudin-1人源化抗体。如本文所用，术语“claudin-1”或“CLDN1”具有其在本领域中的一般含义，并且是指与紧密连接claudin-1相关的整合的膜蛋白。首先从分离的鸡肝连接部分鉴定了22-kD多肽的CLDN1，并克隆编码其小鼠同源物的cDNA(Furuse等，1998)。克隆并测序CLDN1的人cDNA(别名＝SEMP1)(Swisshelm等，1999)。它包含四个外显子，包括636个核苷酸。翻译产生211个氨基酸残基的产物。CLDN1具有四跨膜拓扑结构，具有四个跨膜区。在细胞内，CLDN1表现出7个氨基酸的N-末端、12个氨基酸的环和27个氨基酸的C-末端。细胞外环(ECL)1由53个氨基酸组成，具有两个保守的半胱氨酸。ECL2具有27个氨基酸。术语“人clau-1或人CLDN1”是指具有NCBI登录号NP_066924中所示序列的蛋白质，或任何天然存在的变体。术语Claudin-1的“细胞外结构域”或“胞外域”是指延伸到细胞外空间(即细胞外的空间)的Claudin-1序列的区域。如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”具有相同含义，并且将在本专利技术中同等使用。本文所用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。因此，术语抗体不仅包括完整抗体分子，还包括抗体片段以及抗体和抗体片段的变体(包括衍生物)。在天然抗体中，两条重链通过二硫键相互连接，并且每条重链通过二硫键与轻链连接。有两种类型的轻链，lambda(1)和kappa(k)。有五种主要的重链类型(或同种型)，其决定了抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每条链含有不同的序列结构域。轻链包括两个结构域，可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)。重链包括四个结构域，可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3，统称为CH)。轻链(VL)和重链(VH)的可变区决定了对抗原的结合识别和特异性。轻链(CL)和重链(CH)的恒定区结构域赋予重要的生物学特性，例如抗体链结合、分泌、经胎盘的移动、补体结合和与Fc受体(FcR)的结合。Fv片段是免疫球蛋白Fab片段的N-末端部分，由一条轻链和一条重链的可变部分组成。抗体的特异性在于抗体结合位点和抗原决定簇之间的结构互补性。抗体结合位点由主要来自高变区或互补决定区(CDR)的残基组成。偶尔，来自非高变区或框架区(FR)的残基可参与抗体结合位点或影响整个结构域结构，并因此影响结合位点。互补决定区或CDR是指一起定义天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各自具有三个CDR，分别称为L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3和H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3。因此，抗原结合位点通常包括六个CDR，其包含来自每一个重链和轻链V区的CDR组。框架区(FR)是指插入CDR之间的氨基酸序列。抗体可变结构域中的残基通常根据Kabat等设计的系统编号。该系统如Kabat等，1987，Sequencesof本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人源化抗体，包括a)至少一条由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的抗体可变重链(VH)，或b)至少一条由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的抗体可变轻链(VL)，或c)至少一条由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的抗体可变重链(VH)和至少一条由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的抗体可变轻链(VL)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.22 EP 16305317.61.一种人源化抗体，包括a)至少一条由SEQIDNO：1的氨基酸序列组成的抗体可变重链(VH)，或b)至少一条由SEQIDNO：2的氨基酸序列组成的抗体可变轻链(VL)，或c)至少一条由SEQIDNO：1的氨基酸序列组成的抗体可变重链(VH)和至少一条由SEQIDNO：2的氨基酸序列组成的抗体可变轻链(VL)。2.权利要求1的人源化抗体，包括a)两条由SEQIDNO：1的氨基酸序列组成的抗体可变重链(VH)，或b)两条由SEQIDNO：2的氨基酸序列组成的抗体可变轻链(VL)，或c)两条由SEQIDNO：1的氨基酸序列组成的抗体可变重链(VH)和两条由SEQIDNO：2的氨基酸序列组成的抗体可变轻链(VL)。3.权利要求1的抗体，其是具有选自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的同种型的完整抗体。4.权利要求1的抗体...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·鲍梅特，R·塔瓦尔，
申请(专利权)人：国家医疗保健研究所，斯特拉斯堡大学，斯特拉斯堡教学医院，
类型：发明
国别省市：法国,FR