红细胞膜单抗及其制备方法技术

本发明专利技术提出红细胞膜单抗，包括其可变区的氨基酸序列和核苷酸序列，其中，重链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Gln‑Asp‑Asp‑Gly‑Ser‑Leu‑Ser‑Ser‑Gly，CDR2：Tyr‑Thr‑Phe‑Ser‑Ser‑Tyr，CDR3：Pro‑Leu‑Ala‑Pro‑Val‑Cys；轻链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Tyr‑Ser‑Gln‑Ser‑Tyr，CDR2：Pro‑Ser‑Ser‑Leu‑Ser‑Ala，CDR3：Asn‑Ile‑Pro‑Lys‑Leu‑Leu‑Ile‑Tyr。灵敏度高，特异性高，结果容易判定。同时本发明专利技术还提出了红细胞膜单抗的制备方法。

【技术实现步骤摘要】
红细胞膜单抗及其制备方法
本专利技术属于生物医学
，尤其是一种红细胞膜单抗及其制备方法。
技术介绍
抗体单体分子是由两条相同的重链(H链)和两条相同的轻链(L链)，通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。H链和L链包括氨基(N)端和羧基(C)端，靠近N端的可变区(V区)由高变区/互补决定区(HVR/CDR)和骨架区(FR)组成；靠近C端为恒定区(C区)。重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)形成的蛋白质折叠是抗原结合部位，其中的CDR/HVR是抗体与抗原决定基互补结合的部位，C区引发抗原抗体识别后的反应。单克隆抗体是通过将抗原注入到宿主动物体内启动机体免疫应答而产生的。继而大多数操作都是在体外将来自这些宿主的脾细胞与培养的恶性骨髓瘤细胞进行融合。将独特的细胞克隆分离出来，融合步骤中存活下来的细胞称为杂交瘤。杂交瘤因骨髓瘤特性而可以永生，且容易在培养物中繁殖。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题在于提供一种红细胞膜单抗及其制备方法，包括其可变区的氨基酸序列和核苷酸序列，灵敏度高，特异性高，结果容易判定。实现本专利技术目的的技术解决方案为：红细胞膜单抗，包括重链和轻链，其中，重链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Gln-Asp-Asp-Gly-Ser-Leu-Ser-Ser-Gly，CDR2：Tyr-Thr-Phe-Ser-Ser-Tyr，CDR3：Pro-Leu-Ala-Pro-Val-Cys；轻链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Tyr-Ser-Gln-Ser-Tyr，CDR2：Pro-Ser-Ser-Leu-Ser-Ala，CDR3：Asn-Ile-Pro-Lys-Leu-Leu-Ile-Tyr。进一步的，本专利技术的红细胞膜单抗，所述重链可变区氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。进一步的，本专利技术的红细胞膜单抗，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。进一步的，本专利技术的红细胞膜单抗，所述重链可变区核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。进一步的，本专利技术的红细胞膜单抗，所述轻链可变区核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术还提出红细胞膜单抗的制备方法，包括以下步骤：步骤1：准备试剂：平衡缓冲液、解离缓冲液、再生缓冲液、透析缓冲液、pH中和液；准备设备：ProteinA柱、低温高速离心机、天平、蠕动泵；步骤2：冷冻的腹水在前一日10-15℃融化，用浸湿三蒸水的脱脂棉过滤去除油脂，过滤后的腹水4℃10000rPm离心30min收集上清；填装适量ProteinA填料，用纯化水洗涤5-10倍柱体积，淋洗去除乙醇；步骤3：进行平衡、上样、再平衡、解离、再生、再平衡、透析、回收，保存ProteinA柱，清洗蠕动泵进样管；步骤4：配置试剂：10mMTris-NaCl、0.1M柠檬酸、0.1M甘氨酸缓冲液、20mMTris-NaCl、2MTris、透析缓冲液。本专利技术采用以上技术方案与现有技术相比，具有以下技术效果：本专利技术筛选出红细胞膜单抗，并获得其重链和轻链可变区，测序后得到其独特的核苷酸序列，灵敏度高，特异性高，结果容易判定。附图说明图1是本专利技术的亲和力数据结果图。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施方式，所述实施方式的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本专利技术，而不能解释为对本专利技术的限制。实施例1红细胞膜单抗，包括重链和轻链，其中，重链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Gln-Asp-Asp-Gly-Ser-Leu-Ser-Ser-Gly，CDR2：Tyr-Thr-Phe-Ser-Ser-Tyr，CDR3：Pro-Leu-Ala-Pro-Val-Cys；轻链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Tyr-Ser-Gln-Ser-Tyr，CDR2：Pro-Ser-Ser-Leu-Ser-Ala，CDR3：Asn-Ile-Pro-Lys-Leu-Leu-Ile-Tyr。重链可变区氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。重链可变区核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，轻链可变区核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。如图1所示，该单抗具备良好的亲和力，数据如下表所示：LoadingSampleIDResponseKD(M)kon(1/Ms)kdis(1/s)本专利技术单抗0.73591.08E-104.51E+054.87E-05红细胞膜单抗的制备方法包括以下步骤：步骤1：准备试剂：平衡缓冲液、解离缓冲液、再生缓冲液、透析缓冲液、pH中和液；准备设备：ProteinA柱、低温高速离心机、天平、蠕动泵；步骤2：冷冻的腹水在前一日10-15℃融化，用浸湿三蒸水的脱脂棉过滤去除油脂，过滤后的腹水4℃10000rPm离心30min收集上清；填装适量ProteinA填料，用纯化水洗涤5-10倍柱体积，淋洗去除乙醇；步骤3：进行平衡、上样、再平衡、解离、再生、再平衡、透析、回收，保存ProteinA柱，清洗蠕动泵进样管；步骤4：配置试剂：10mMTris-NaCl、0.1M柠檬酸、0.1M甘氨酸缓冲液、20mMTris-NaCl、2MTris、透析缓冲液。实施例2红细胞膜单抗的制备方法如下：1、准备：1)试剂准备：平衡缓冲液：10mMTris-NaCl(pH8.3)解离缓冲液：0.1M柠檬酸(pH4.0)再生缓冲液：0.1M甘氨酸(pH2.7)透析缓冲液：20mMTris-NaCl(pH7.5)或10mMPBS(pH7.4)pH中和液：2MTris(pH8.0)2)设备准备：ProteinA柱、低温高速离心机、天平、蠕动泵。2、操作步骤1)样品准备：冷冻的腹水在前一日10-15℃融化，用浸湿三蒸水的脱脂棉过滤去除油脂，过滤后的腹水4℃10000rPm离心30min收集上清；柱准备：填装适量ProteinA填料，用纯化水洗涤5-10倍柱体积，淋洗去除乙醇。2)平衡：ProteinA柱用平衡缓冲液平衡5倍柱体积；3)上样：腹水用两倍体积的平衡缓冲液10mMTris-NaCl(pH8.3)稀释作为样品上样，使用蠕动泵在20-25℃条件下缓慢上样；4)平衡：上样完成后再用平衡缓冲液10mMTris-NaCl(pH8.3)淋洗5-10倍柱体积，平衡至无蛋白流出，即蛋白紫外检测仪显示值为0；5)解离：平衡完成后使用0.1M柠檬酸(pH4.0)进行解离，当蛋白紫外检测仪显示值大于0.3时开始收集蛋白，当蛋白紫外检测仪显示值小于0.3时停止收集蛋白；6)再生：解离完成后用0.1M甘氨酸(pH2.7)缓冲液进行再生约2倍柱体积；7)平衡：再生完成后用平衡缓冲液10mMTris-NaCl(pH8.3)平衡柱约5-10倍柱体积；8)透析：合并含蛋白组分使用透析缓冲液20mMTris-NaCl(pH7.5)或10mMPBS(pH7.4)进行透析，透析比例为1:50，换液3次，每次透析时间不低于4小时；9)抗体处理：透析完成后回收抗体并用0.22μm滤膜过滤后添加0.09％NaN3保存蛋白。3、ProteinA柱保存：ProteinA柱长期不使用则柱内填充20％乙醇，4-8本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.红细胞膜单抗，其特征在于，包括重链和轻链，其中，重链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Gln‑Asp‑Asp‑Gly‑Ser‑Leu‑Ser‑Ser‑Gly，CDR2：Tyr‑Thr‑Phe‑Ser‑Ser‑Tyr，CDR3：Pro‑Leu‑Ala‑Pro‑Val‑Cys；轻链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Tyr‑Ser‑Gln‑Ser‑Tyr，CDR2：Pro‑Ser‑Ser‑Leu‑Ser‑Ala，CDR3：Asn‑Ile‑Pro‑Lys‑Leu‑Leu‑Ile‑Tyr。

【技术特征摘要】
1.红细胞膜单抗，其特征在于，包括重链和轻链，其中，重链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Gln-Asp-Asp-Gly-Ser-Leu-Ser-Ser-Gly，CDR2：Tyr-Thr-Phe-Ser-Ser-Tyr，CDR3：Pro-Leu-Ala-Pro-Val-Cys；轻链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Tyr-Ser-Gln-Ser-Tyr，CDR2：Pro-Ser-Ser-Leu-Ser-Ala，CDR3：Asn-Ile-Pro-Lys-Leu-Leu-Ile-Tyr。2.根据权利要求1所述的红细胞膜单抗，其特征在于，所述重链可变区氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求1所述的红细胞膜单抗，其特征在于，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。4.根据权利要求1所述的红细胞膜单抗，其特征在于，所述重链可变区核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：李永刚，王玉婷，蔡帅，李伟，
申请(专利权)人：南京京达生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32