检测叶酸代谢能力相关基因的引物、探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测叶酸代谢能力相关基因的引物、探针，属于生物医学技术领，本发明专利技术还提供了一种包含上述引物及探针的试剂盒。本发明专利技术提供的检测叶酸代谢能力相关基因的引物和探针特异性好能够提高SNP位点检测特异性；使用该试剂盒进行MTHFR和MTRR基因多态性的检测，检测结果与测序结果准确率高达100％，可三管同时检测样本的三个位点的纯合野生型、纯合突变型和杂合型，检测效率高；同时相比使用ΔCt值法的判断结果更易判断，结果可以通过分型软件准确分型，还可以通过荧光定量PCR曲线进行确认复核，结果更为准确可靠。

【技术实现步骤摘要】
检测叶酸代谢能力相关基因的引物、探针及试剂盒
本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种检测叶酸代谢能力相关基因的引物、探针及试剂盒。
技术介绍
叶酸是一种水溶性B族维生素，人体自身不能合成，必须从外界摄入。孕妇对叶酸的需求量比正常人高4倍，适当补充叶酸能够有效地降低胎儿畸形发生的概率；中老年人补充叶酸能明显的预防和治疗多种疾病，研究发现，适量补充叶酸可以有效降低脑卒中发生的风险，可以预防和延缓老年认知障碍的发生。叶酸代谢能力受遗传因素的影响，某些基因的突变会影响叶酸的利用，其中，5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)是叶酸利用代谢关键酶；MTHFR基因第1298位碱基A突变为C，产生三种基因型：野生型(A/A)，杂合突变型(A/C)和纯合突变型(C/C)，该三种基因型在中国人群中分布所占比例为67％、29％、4％。基因型(C/C)会引起MTHFR活性下降，同型半胱氨酸转化为蛋氨酸能力下降，导致血浆中半胱氨酸升高。MTHFR基因第677位碱基C突变为T，产生三种基因型：野生型(C/C),杂合突变型(C/T)和纯合突变型(T/T)，该三种基因型在中国人群中分布所占比例为33％、44％、23％。碱基突变导致MTHFR酶活性降低，同型半胱氨酸转化能力下降，导致血浆中半胱氨酸浓度升高。甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)也是叶酸代谢的关键酶之一，MTRR基因第66位碱基A突变为G，产生三种基因型：野生型(A/A)，杂合突变型(A/G)和纯合突变型(G/G)，该三种基因型在中国人群中分布所占比例为55％、38％、7％。碱基突变引起MTRR酶活性下降，导致高同型半胱氨酸血症和叶酸利用能力下降。对MTHFR基因和MTRR基因及其相关位点的检测，通过检测结果可以直接知道被检测者叶酸代谢能力是否有遗传缺陷，不同的基因型对应的叶酸补充量不同，叶酸个体化的补充对预防疾病的发生具有重要意义。公开号为CN107254520A和CN108004309A的中国专利，使用DNA直接测序法对MTHFR基因和MTRR基因进行PCR扩增后检测，但该方法需要对扩增后的样品进行纯化、再次扩增分析序列，检测步骤繁琐、复杂，对环境及操作人员要求较高、需要昂贵的仪器设备、成本高，在临床上具有一定的限制；公开号为CN104774944A和CN105986010A的中国专利公开了使用质谱法检测叶酸代谢相关基因型的方法和试剂盒，这种方法通过引物长度及碱基的相对分子质量进行区分，通量高，灵敏度高但需要结合质谱仪进行分型，使用的仪器设备昂贵，并且对操作人员技术要求高，实用性及普及性受限。同时现有针对全血样本核酸提取检测叶酸代谢能力的试剂盒存在操作时间长、试剂成本高等问题。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种准确率高的、可快速完成核酸提取的用于检测叶酸代谢能力相关基因的试剂盒。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：检测叶酸代谢能力相关基因的引物和探针，包括以下引物和探针：MTHFR基因C677T引物：MTHFR677F和MTHFR677R；MTHFR基因A1298C引物：MTHFR1298F和MTHFR1298R；MTRR基因A66G引物：MTRR66F和MTRR66R；MTHFR基因C677T探针：MTHFR677C和MTHFR677T；MTHFR基因A1298C探针：MTHFR1298A和MTHFR1298C；MTRR基因A66G探针：MTRR66A和MTRR66G；所述探针的3’端用MGB修饰。检测叶酸代谢能力相关基因的试剂盒，包括3个反应体系：PCR反应体系1、PCR反应体系2和PCR反应体系3；PCR反应体系1包括MTHFR677F、MTHFR677R、MTHFR677C和MTHFR677T；PCR反应体系2包括MTHFR1298F、MTHFR1298R、MTHFR1298A和MTHFR1298C；PCR反应体系3所述的MTRR66F、MTRR66R、MTRR66A和MTRR66G。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的引物及探针特异性好能够提高SNP位点检测特异性；本专利技术还提供了一种包含上述引物及探针的试剂盒，使用该试剂盒进行MTHFR和MTRR基因多态性的检测，检测结果与测序结果准确率高达100％，可三管同时检测样本的三个位点的纯合野生型、纯合突变型和杂合型，检测效率高；同时相比使用ΔCt值法的判断结果更易判断，结果可以通过分型软件准确分型，还可以通过荧光定量PCR曲线进行确认复核，结果更为准确可靠。附图说明图1所示为本专利技术具体实施方式的MTHFRA1298C野生纯合型扩增曲线；图2所示为本专利技术具体实施方式的MTHFRA1298C杂合型扩增曲线；图3所示为本专利技术具体实施方式的MTHFRA1298C突变纯合型扩增曲线；图4所示为本专利技术具体实施方式的MTHFRC677T野生纯合型扩增曲线；图5所示为本专利技术具体实施方式的MTHFRC677T杂合型扩增曲线；图6所示为本专利技术具体实施方式的MTHFRC677T突变纯合型扩增曲线；图7所示为本专利技术具体实施方式的MTRRA66G野生纯合型扩增曲线；图8所示为本专利技术具体实施方式的MTRRA66G杂合型扩增曲线；图9所示为本专利技术具体实施方式的MTRRA66G突变纯合型扩增曲线；图10所示为本专利技术具体实施方式的MTHFRA1298C位点检测样本分型结果；图11所示为本专利技术具体实施方式的MTHFRC677T位点检测样本分型结果；图12所示为本专利技术具体实施方式的MTRRA66G位点检测样本分型结果；图13所示为本专利技术具体实施方式的23例已知基因型的样本的MTHFRA1298C位点检测样本分型结果；图14所示为本专利技术具体实施方式的23例已知基因型的样本的MTHFRC677T位点检测样本分型结果；图15所示为本专利技术具体实施方式的23例已知基因型的样本的MTRRA66G位点检测样本分型结果。具体实施方式为详细说明本专利技术的
技术实现思路
、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。本专利技术最关键的构思在于：设计SEQIDNO.1-12所示的6条引物和6条探针及包含上述引物和探针的试剂盒，实现MTHFR基因2个位点6种基因型和MTRR基因1个位点3种基因型的同步检测。本专利技术的检测叶酸代谢能力相关基因的引物和探针，包括以下引物和探针：MTHFR基因C677T引物：MTHFR677F和MTHFR677R；MTHFR基因A1298C引物：MTHFR1298F和MTHFR1298R；MTRR基因A66G引物：MTRR66F和MTRR66R；MTHFR基因C677T探针：MTHFR677C和MTHFR677T；MTHFR基因A1298C探针：MTHFR1298A和MTHFR1298C；MTRR基因A66G探针：MTRR66A和MTRR66G；所述探针的3’端均用MGB修饰，所述探针的5’端的荧光修饰基团不限，如FAM、HEX、cy3、cy5。上述引物和探针序列为如下，见表1和表2：表1名称(引物)序列(5’-3’)碱基数MTHFR677F(SEQIDNO.1)CACAAAGCGGAAGAATGTGTCAG23MTHFR677R(SEQIDNO.2)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测叶酸代谢能力相关基因的引物和探针，其特征在于，包括以下引物和探针：MTHFR基因C677T引物：MTHFR677F和MTHFR677R；MTHFR基因A1298C引物：MTHFR1298F和MTHFR1298R；MTRR基因A66G引物：MTRR66F和MTRR66R；MTHFR基因C677T探针：MTHFR677C和MTHFR677T；MTHFR基因A1298C探针：MTHFR1298A和MTHFR1298C；MTRR基因A66G探针：MTRR66A和MTRR66G；所述探针的3’端用MGB修饰。

【技术特征摘要】
1.检测叶酸代谢能力相关基因的引物和探针，其特征在于，包括以下引物和探针：MTHFR基因C677T引物：MTHFR677F和MTHFR677R；MTHFR基因A1298C引物：MTHFR1298F和MTHFR1298R；MTRR基因A66G引物：MTRR66F和MTRR66R；MTHFR基因C677T探针：MTHFR677C和MTHFR677T；MTHFR基因A1298C探针：MTHFR1298A和MTHFR1298C；MTRR基因A66G探针：MTRR66A和MTRR66G；所述探针的3’端用MGB修饰。2.检测叶酸代谢能力相关基因的试剂盒，其特征在于，包括3个反应体系：PCR反应体系1、PCR反应体系2和PCR反应体系3；所述PCR反应体系1包括权利要去1所述的MTHFR677F、MTHFR677R、MTHFR677C和MTHFR677T；所述PCR反应体系2包括权利要去1所述的MTHFR1298F、MTHFR1298R、MTHFR1298A和MTHFR1298C；所述PCR反应体系3包括权利要去1所述的MTRR66F、MTRR66R、MTRR66A和MTRR66G。3.根据权利要求2所述的检测叶酸代谢能力相关基因的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应体系1、PCR反应体系2和PCR反应体系3还包括预混液2×qPCRMix，所述预混液2×qPCRMix包括PCR缓冲液、dNTP、Mg2+、Taq酶、UNG酶和无菌纯水，所述dNTP包括dATP、dUTP、dCTP和dGTP。...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷秀清，
申请(专利权)人：阿吉安福州基因医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35