重组酮酸还原酶突变体、基因、工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了重组酮酸还原酶突变体、基因、工程菌及其应用,所述重组酮酸还原酶突变体是将SEQ ID NO：2所示氨基酸序列第127位、第244位、第245位或第250位进行单位点或多位点突变获得的，所述突变包括定点饱和突变、组合突变或者迭代饱和突变。以2‑氧代‑4‑苯基丁酸为模式底物时，底物装载量由提升至250mM，ee值均大于99％。最终应用于2‑氧代‑4‑苯基丁酸不对称还原制备光学纯(R)‑2‑羟基‑4‑苯基丁酸。该反应具有成本低、绿色环保、工艺简单、催化效率高、无需添加外源性辅酶等优势，工业化前景广阔。

【技术实现步骤摘要】
重组酮酸还原酶突变体、基因、工程菌及其应用(一)
本专利技术涉及一种重组酮酸还原酶突变体、基因、重组载体、工程菌及其在制备(R)-2羟基-4-苯基丁酸中的应用。(二)
技术介绍
光学纯α-羟酸是一类在羧酸侧C2位有羟基取代的活性化合物，其种类繁多、性质活泼，是重要的药物和精细化工手性中间体，在医药化工等领域具有重要的应用价值。其中，较为重要的是光学纯芳香族的α-羟酸及其衍生物，(R)-2-羟基-4-苯基丁酸是合成众多血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)类治疗高血压和充血性心力衰竭药物的关键手性中间体，目前已经上市的普利类药物已达到数十种。正是由于(R)-2-羟基-4-苯基丁酸在医药行业的重要应用，是得其合成方法一直以来受到了诸多的关注。主要可以分为二类，即化学法和生物法。化学法分为化学拆分法和化学合成法。化学拆分法主要利用手性拆分试剂将(R,S)-2-羟基-4-苯基丁酸((R,S)-HPBA)形成非对映体盐，从而增加原对映异构体物理性质差异，然后再进行结晶分离；该法具有产物的纯度、产率不高(最高50％)、手性拆分试剂昂贵、反应有一定的毒性及环境污染等缺点。同时，化学合成法过程中需要昂贵的手性辅助试剂和手性起始原料，整个的合成过程复杂而冗长，并且反应条件苛刻；反应过程使用的大量有机溶剂无法回收，手性试剂昂贵。化学法的上述缺点严重的阻碍了其在普利类药物的合成中的应用。生物法中主要有酶法拆分、不对称还原法、腈水解酶法。总体而言，生物法所得产品纯度较高，反应条件温和、环境友好。酶法拆分，酶法拆分法制备光学纯的2-羟酸通常是利用生物酶选择性的衍生外消旋-羟酸中的一种构型而得到另外一种单一构型的目标构型，主要是利用蛋白酶、脂肪酶。该方法保留了生物酶法的优势，但是最大的缺点是理论收率仅有50％。同时，也有利用脂肪酶选择性拆分外消旋体2-羟酸酯得到单一构型的酯化物，但是该方法目前的水平较低，缺乏高效的催化剂。腈水解酶法，腈水解酶是一类重要的水解酶，可以催化腈类底物一步转化为相应的光学纯羟酸，具有较好的催化特性，目前关于腈水解酶法制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸的研究较少。此外，由于该方法在催化过程中会产生等量剧毒的氢氰酸(HCN)，从而增加了操作的危险性和操作难度。不对称还原法，性的生物合成和转化是利用酶或微生物催化反应对底物立体选择性地将潜手性化合物转化成单一光学活性产物。该法的优点是理论产率高，操作简单。生物不对称还原在总收率和对映选择性方面比生物拆分更有优势。同时，相对于外消旋化合物，潜手性的2-酮酸底物不易获得、价格昂贵，限制了该方法的应用。在应用生物法不对称还原的策略制备光学纯2-羟酸时，发现酮酸还原酶的活性严重限制了整体的催化效率，导致了底物装载量和产率相对与工业化的方法较低。因此，寻找具有高活性和底物耐受性的酮酸还原酶用于潜手性2-酮酸的不对称还原，对实现潜手性的2-酮酸的高效不对称还原酶具有重要的意义。酮酸还原酶是一类重要的氧化还原酶，能够催化潜手性酮酸不对称还原为单一构型的2-羟酸，同时需要NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)或NADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)做辅因子参与还原反应。目前，已经发现的酮酸还原酶特定的底物谱。已经发现的酮酸还原酶对有C3、C4支链的酮酸底物具有很低的催化活力，甚至没有催化活力。本研究从实验室已有的酮酸还原酶中筛选到了一株对C3、C4支链的酮酸底物有较高活力的酮酸还原酶(LlKAR)，该酶属于D-扁桃酸脱氢酶；同时，以2-氧代-4-苯基丁酸作为模式底物，对LlKAR进行了分子改造，提高催化活力；这对于实现潜手性芳香族2-酮酸底物的高效不对称还原具有重要的应用价值。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种重组酮酸还原酶突变体、编码基因、含有该突变体基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，以及其在制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸中的应用。本专利技术提供的重组酮酸还原酶突变体具有较高的底物耐受性、较高的催化活力，反应条件温和，催化效率提高，生产成本降低且对环境友好。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种重组酮酸还原酶突变体，所述重组酮酸还原酶突变体是将SEQIDNO：2所示氨基酸序列第127位、第244位、第245位或第250位进行单位点或多位点突变获得的，所述突变包括定点饱和突变、组合突变或者迭代饱和突变。进一步，所述酮酸还原酶突变体为下列之一：SEQIDNO.2氨基酸序列127位的亮氨酸突变为异亮氨酸(即突变体LlKAR-L127I(mut-L127I))、SEQIDNO.2氨基酸序列第244位亮氨酸突变为甘氨酸(LlKAR-L244G(即mut-L244G))、SEQIDNO.2氨基酸序列第250位的丙氨酸突变为甘氨酸(LlKAR-A250G(mut-A250G))、SEQIDNO.2氨基酸序列第127位亮氨酸突变为异亮氨酸且第244位亮氨酸突变为甘氨酸(LlKAR-L127I/L244G(即mut-L127I/L244G))、SEQIDNO.2氨基酸序列127位的亮氨酸突变为异亮氨酸且第250位的丙氨酸突变为甘氨酸(LlKAR-L127I/A250G(即mut-L127I/A250G))、SEQIDNO.2氨基酸序列第244位亮氨酸突变为甘氨酸且第250位的丙氨酸突变为甘氨酸(LlKAR-L244G/A250G(即mut-L244G/A250G))、SEQIDNO.2氨基酸序列第244位亮氨酸突变为甘氨酸+第250位的丙氨酸突变为甘氨酸+第245位亮氨酸突变为精氨酸(LlKAR-L244G/A250G/L245R(即mut-L244G/A250G/L245R))。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有该专利技术所示氨基酸序列的肽蛋白片段或其突变体，如其保守性突变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白突变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上，均属于该专利技术保护范围之列。具体所述改变氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于突变体的保守性改变，所提还的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，突变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。由于核苷酸序列的特殊性，任何本专利技术所示多核苷酸的突变体，只要其与前述多核苷酸具有90％以上同源性，均属于本专利技术保护范围之列。所述多核苷酸的突变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，他可能是一个多核苷酸的取代、确实或插入，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。本专利技术还涉及含所述重组酮酸还原酶突变体编码基因的重组载体。所述重组载体包含与适合指导在宿主细胞中表达的控制序列可操作地连接的多核苷酸。优选该表达载体为PET-28b。本专利技术涉及含所述重组酮酸还原酶突变体编码基因和葡萄糖脱氢酶(GDH)的共表达载体。所述共表达载体包含与适合指导在宿主细胞中表达的控制序列可操作地连接的多核苷酸。优选该共表达表达载体为pCDF-Duet。所述葡萄糖脱氢酶(GDH)编码基因核苷酸序列为SEQIDNO.3所示。本专利技术涉及利用所述重组载体转化得到的重组基因工程菌，具体为：将重组酮酸还原酶突变体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组酮酸还原酶突变体，其特征在于所述重组酮酸还原酶突变体是将SEQ ID NO：2所示氨基酸序列第127位、第244位、第245位或第250位进行单位点或多位点突变获得的。

【技术特征摘要】
1.一种重组酮酸还原酶突变体，其特征在于所述重组酮酸还原酶突变体是将SEQIDNO：2所示氨基酸序列第127位、第244位、第245位或第250位进行单位点或多位点突变获得的。2.如权利要求1所述重组酮酸还原酶突变体，其特征在于所述酮酸还原酶突变体为下列之一：SEQIDNO.2氨基酸序列127位的亮氨酸突变为异亮氨酸、SEQIDNO.2氨基酸序列第244位亮氨酸突变为甘氨酸、SEQIDNO.2氨基酸序列第250位的丙氨酸突变为甘氨酸、SEQIDNO.2氨基酸序列第亮氨酸突变为异亮氨酸且第244位亮氨酸突变为甘氨酸、SEQIDNO.2氨基酸序列127位的亮氨酸突变为异亮氨酸且第250位的丙氨酸突变为甘氨酸、SEQIDNO.2氨基酸序列第244位亮氨酸突变为甘氨酸且第250位的丙氨酸突变为甘氨酸、SEQIDNO.2氨基酸序列第244位亮氨酸突变为甘氨酸+第250位的丙氨酸突变为甘氨酸+第245位亮氨酸突变为精氨酸。3.一种权利要求1所述重组酮酸还原酶突变体的编码基因。4.一种权利要求3所述重组酮酸还原酶突变体的编码基因构建的工程菌。5.一种权利要求1所述重组酮酸还原酶突变体催化2-氧代-4-苯基丁酸制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：以含重组酮酸还原酶突变体编码基因和葡萄糖脱氢酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体分离纯化获得的纯酶为催化剂，以2-氧代-4-苯基丁酸为底物，以葡萄糖为辅底物，以pH6.0-8.0的缓冲液为反应介质构成反应体系，在25-60℃、200-700rpm条件下反应完全后，得到含有(R)-2-羟基-4-苯基丁酸的转化液，分离纯化，获得(R)-2-羟基-4-苯基丁酸。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛亚平，郑裕国，王地臣，李恒，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33