一种精准高通量单分子力谱方法技术

本发明专利技术提供一种精准高通量单分子力谱方法，包括以下步骤：1)以DNA折纸为基底，根据该DNA折纸的几何结构在该DNA折纸上分别选取若干修饰位点，在所选修饰位点的寡核苷酸链的5’端延伸一段目标DNA短链，所述目标DNA短链可与固定于AFM探针上的DNA短链互补配对；以及2)采用原子力显微镜单分子力谱的方法对位于DNA折纸和AFM探针上的两条互补DNA短链间的相互作用力进行测定，并收集特异性力‑距曲线数据。本发明专利技术提供了一种检测效率高，特异性和精准度均得到提高的精准高通量单分子力谱方法，这种简便，高效的高通量单分子力谱方法为单分子力学的定量测量提供了一种高效而精确的测量手段。

【技术实现步骤摘要】
一种精准高通量单分子力谱方法
本专利技术涉及单分子力谱测量领域，更具体地涉及一种精准高通量单分子力谱方法。
技术介绍
对于生物分子内及分子间的相互作用，如生物分子内部结构的变化及分子间相互识别作用，都可以用力学性质来定性和定量研究。单分子水平上的探测手段是研究上述作用力的必然要求。在过去的数十年中随着科学技术在世界范围内的快速发展，先后涌现了多种单分子力谱测量技术，如光镊技术、磁镊技术、以及基于原子力显微镜的单分子力谱技术等。但对于光镊技术的主要局限是：在测量时，光束在一定程度上会对生物样品造成光损伤和热损伤；光陷阱在捕获微球时具有非特异性，任何物体都有可能被捕获，并且任何对光造成的干扰都会影响光陷阱的稳定性，因此，要求待测生物样品具有非常高的纯度和非常低的浓度。而对于磁镊技术的主要缺点在于：在测量过程中对磁性微球的位移检测是通过相机拍照实现的，因此，对磁性微球位置检测的准确性和实时性受到相机像素和响应时间的限制。而对于原子力显微镜，除了众所周知的成像功能外，AFM还可以利用基于AFM的力谱技术在单分子水平上检测生物分子间的相互作用，并对分子间的相互作用力给出定量的描述，精度可达到pN量级，是研究单分子相互作用力的重要的方法。AFM-SMFS在单分子水平上测量力的操纵过程中，是将目标分子通过化学反应或物理吸附分别固定在基底和针尖上，通过针尖相对于基底在垂直方向运动，系统记录针尖靠近基底和从基底回退过程中微悬臂弯曲方向和弯曲程度的变化。根据Hooke定律F＝kx计算出针尖与基底分子间相互作用力的大小，得到力谱测量过程中的力-距曲线。但是，AFM单分子力谱研究中存在两大类问题，检测效率低，特异性和精准度较差。单分子力谱测量的关键在于有效控制所测量的单个分子内或单个分子间的作用力。为了实现单分子力谱的测量，现在多采用稀释法获得单个分子，或若干个单分子修饰的探针或衬底，此方法效率较低。生物分子在探针和衬底表面上的非特异性吸附也普遍存在以下缺陷：一是所修饰的分子的具体位置不能确定；二所修饰分子的空间取向无法确定；三是不能实现高通量检测。这些缺陷使得力谱数据的采集与分析变得比较困难。在过去的三十年里，DNA是大多数活的生物体中遗传信息的载体，现作为构建纳米级物体的材料其作用日益扩大。尤其是一种被称为DNA折纸的技术，已经使得研究人员能够设计出任意形状的复杂的二维或三维纳米结构。DNA折纸术是从2006年起发展最迅猛的纳米技术，其分子折叠过程一般是：把一个长单链DNA(脚手架链)，通常是M13噬菌体基因组DNA(M13mp18)和数百条合成的DNA短寡核苷酸(通常20-60bp长，其被设计成与支架DNA的不同部分互补)，以合适的摩尔化学计量比在1xTAE缓冲液中混合，加热至高温，并缓慢冷却以使互补序列相互杂交形成预设形状的纳米结构。一般通过设计不同的寡核苷酸链，可使DNA组装成不同的结构；同时由于寡核苷酸链末端可被多种分子修饰，通过这种能力，DNA折纸能够构建定制仪器来执行分子相互作用和结构的精确测量，并可以对目标分子进行定位、定向的操纵。但是，现有技术中并没有一种能够利用DNA折纸的定向定位功能进行单分子力谱测定的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种精准高通量单分子力谱方法，从而解决现有技术中单分子力谱方法存在检测效率低，特异性和精准度较差的问题。为了解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：提供一种精准高通量单分子力谱方法，包括以下步骤：1)以DNA折纸为基底，根据该DNA折纸的几何结构在该DNA折纸上分别选取若干修饰位点，在所选修饰位点的寡核苷酸链的5’端延伸一段目标DNA短链，所述目标DNA短链可与固定于AFM探针上的DNA短链互补配对；以及2)采用原子力显微镜单分子力谱的方法对位于DNA折纸和AFM探针上的两条互补DNA短链间的相互作用力进行测定，并收集特异性力-距曲线数据。本专利技术的专利技术点主要在于利用具有可编程寻址功能的DNA折纸作为AFM-SMFS力学测定中的基底，以弥补一般基底中存在的位置和取向不可控的缺陷，提供了一种能够精准高通量定点做单分子力谱的方法。所述DNA折纸图案可根据需要设计，应当知晓的是，适用于本专利技术的DNA折纸是具有任意一种形状的二维或三维纳米结构。所述步骤1)可选地包括：以一条长链DNA为主链，与若干订书钉单链以及若干目标DNA短链混合进行杂交反应，实现目标DNA短链在DNA折纸上的修饰。根据本专利技术的一个优选实施方式，所述步骤1)具体包括：将脚手架链M13mp18DNA与若干订书钉单链以及目标DNA短链按1：10：10的摩尔比混合后置于1xTAE/Mg2+缓冲液体系中，再置于PCR仪上从95℃退火至20℃，退火速度为0.1℃/10s。所述步骤2)包括：将合成的带有目标DNA短链的DNA折纸溶液滴加于衬底上吸附一定时间，之后置于原子力显微镜的样品台上，于液相PeakforceTapping模式下的SpotandShoot对DNA折纸进行成像，然后利用单点Ramp功能在目标位点做特异性力-距曲线。所述带有目标DNA短链的DNA折纸溶液的浓度优选为1～5nM，最优选为3nM。所述带有目标DNA短链的DNA折纸溶液的用量优选为1～5μL，最优选为2μL。吸附时间优选为2～5min，最优选为3min。DNA短链在AFM探针上的固定是通过修饰在该DNA短链的3’端的巯基与AFM探针上的镀金表面在室温下反应1～3h完成。所述DNA短链在AFM探针上的固定所采用的DNA短链的浓度优选为1～10nM，最优选为5nM。所述DNA短链在AFM探针上的固定所采用的DNA短链的用量优选为50～150μL，最优选为100μL。所述的修饰探针的DNA单链修饰探针的时间最佳为2h。适用于本专利技术的原子力显微镜为本领域常规使用的一种仪器，例如，具有NANOscopeⅤ型控制系统的Bruker8型扫描隧道显微镜，NANOscope8.15版本的软件(Bruker)用于数据收集。该原子力显微镜扫描头、原子力显微镜探针均为本领域常规使用，例如，原子力显微镜扫描头为J型扫描头，AFM探针为BL-TR400PB的全镀金的氮化硅探针(弹性系数0.06Nm-1，Mikromash公司)。所述步骤2)中所使用的衬底是新解离的云母片，云母片预先被黏附于铁片上，使用时将云母进行剥离以获得非常平整且干净的云母片，然后把样品滴于上面吸附2-5min，然后置于原子力显微镜的样品台上进行AFM成像。根据本专利技术的一个优选实施方式，此处仅作为举例而非限制，以一种三角形DNA折纸为基底，在其三条边上分别选取六个修饰位点，所选修饰位点的寡核苷酸链的5`端伸出20个碱基，其中5’端的20个碱基可与固定于AFM针尖上的DNA短链互补配对，采用AFM单分子力谱的方法测定两条互补链间的相互作用力。根据该优选实施方式，所述的DNA折纸的三条边上共18条短链的5`端所伸出的20个碱基能与修饰在探针上的DNA短链能互补配对形成DNA双链。根据该优选实施方式，所述的5`端所伸出的20个碱基的18条链固定于折纸设定位点上的方式为本领域常规技术手段。根据该优选实施方式，所述的修饰在针尖上的互补DNA短链，其3’端用巯基修饰并且与20个碱基间相隔30个T碱基和6本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种精准高通量单分子力谱方法，其特征在于，包括以下步骤：1)以DNA折纸为基底，根据该DNA折纸的几何结构在该DNA折纸上分别选取若干修饰位点，在所选修饰位点的寡核苷酸链的5’端延伸一段目标DNA短链，所述目标DNA短链可与固定于AFM探针上的DNA短链互补配对；以及2)采用原子力显微镜单分子力谱的方法对位于DNA折纸和AFM探针上的两条互补DNA短链间的相互作用力进行测定，并收集特异性力‑距曲线数据。

【技术特征摘要】
1.一种精准高通量单分子力谱方法，其特征在于，包括以下步骤：1)以DNA折纸为基底，根据该DNA折纸的几何结构在该DNA折纸上分别选取若干修饰位点，在所选修饰位点的寡核苷酸链的5’端延伸一段目标DNA短链，所述目标DNA短链可与固定于AFM探针上的DNA短链互补配对；以及2)采用原子力显微镜单分子力谱的方法对位于DNA折纸和AFM探针上的两条互补DNA短链间的相互作用力进行测定，并收集特异性力-距曲线数据。2.根据权利要求1所述的精准高通量单分子力谱方法，其特征在于，所述DNA折纸是具有任意一种形状的二维或三维纳米结构。3.根据权利要求1所述的精准高通量单分子力谱方法，其特征在于，所述步骤1)包括：以一条长链DNA为主链，与若干订书钉单链以及若干目标DNA短链混合进行杂交反应，实现目标DNA短链在DNA折纸上的修饰。4.根据权利要求3所述的精准高通量单分子力谱方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括：将脚手架链M13mp18DNA与若干订书钉单链以及目标DNA短链按1：10：10的摩尔比混合后置于1xTAE/Mg2+缓冲液体系中，再置于PCR仪上从95℃退火至20℃，退火速度为0.1℃/10s。5.根据权利要求1所述的精准高通量单分子力谱方法，其特征在于，所述步骤2)包括：将合成的带有目标DNA短链的DNA折纸溶液滴加于...

【专利技术属性】
技术研发人员：李宾，刘文静，张萍，
申请(专利权)人：中国科学院上海应用物理研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31