一种赭曲霉毒素A降解酶及其应用和检测赭曲霉毒素A的免疫层析试纸条制造技术

本发明专利技术涉及免疫检测技术领域，公开了一种赭曲霉毒素A降解酶及其应用和检测赭曲霉毒素A的免疫层析试纸条。本发明专利技术所述赭曲霉毒素A降解酶具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。本发明专利技术利用所述赭曲霉毒素A降解酶特异性结合赭曲霉毒素A的特性制作胶体金免疫层析试纸条，与赭曲霉毒素A具有更高的亲和力，灵敏度高；具有更强的特异性，与其他毒素无交叉；且受体可以体外原核表达，与抗体相比较具有产量高，周期短，成本低的优势，且整个过程可控；免疫层析试纸条检测赭曲霉毒素A时无需任何其他试剂，加入处理后的样品液后，5‑10min即可获得结果，大大提高效率，可实现赭曲霉毒素A的现场快速检测。

【技术实现步骤摘要】
一种赭曲霉毒素A降解酶及其应用和检测赭曲霉毒素A的免疫层析试纸条
本专利技术涉及免疫检测
，具体涉及一种赭曲霉毒素A降解酶及其应用和检测赭曲霉毒素A的免疫层析试纸条。
技术介绍
据调查发现，全球40％以上的粮食作物在储存和运输过程中受霉菌的影响，且霉菌在代谢过程中产生毒素。真菌毒素是产毒真菌产生的一类次生代谢产物，主要包括黄曲霉毒素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素、赭曲霉毒素和T-2毒素等。其中赭曲霉毒素是继黄曲霉毒素后又一种重要的污染食品的真菌毒素。赭曲霉毒素由赭曲霉和纯绿青霉产生，包括结构类似的一类化合物，其中以赭曲霉毒素A的分布最广，毒性最大，国际癌症机构已将其定为B类致癌物。目前报道的赭曲霉毒素主要存在于小麦、玉米、大米、饲料等中。目前对赭曲霉毒素A检测方法主要有酶联免疫吸附法、免疫亲和柱和荧光分光光度法及高效液相色谱法相结合、高效液相色谱和串联质谱法相结合等，虽然这些方法检测数据准确，分辨率高等，但是它们操作步骤繁琐，耗时较长，对实验人员技术要求高，且仪器价格昂贵，不适合现场快速检测，因此急需开发快速高效、特异准备、操作简便的赭曲霉毒素A的检测方法。胶体金免疫层析法是近年来出现的一种操作简单快速、成本低廉，便于现场操作的检测方法。胶体金免疫层析法利用抗原抗体特异性识别进行检测，但是抗体制作成本高，周期长，批间差异大，不利于产品的制作。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种赭曲霉毒素A降解酶，使其能够特异性结合赭曲霉毒素A，并可应用于赭曲霉毒素A的免疫检测中；本专利技术的另外一个目的在于提供一种基于上述赭曲霉毒素A降解酶的检测赭曲霉毒素A的免疫层析试纸条，使得所述试纸条能够检测赭曲霉毒素A，并具备较高的特异性和灵敏度，检测效率高，制备工艺简单。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种赭曲霉毒素A降解酶，具有如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。本专利技术所提供的赭曲霉毒素A降解酶可以与黄曲霉毒素特异结合，基于这种特性采用类似Elisa方法中的竞争法原理，让赭曲霉毒素A-胶体金标记物和待测样品中的赭曲霉毒素A竞争结合所述赭曲霉毒素A降解酶，以此实现检测赭曲霉毒素A的目的。基于此，本专利技术提供了所述赭曲霉毒素A降解酶在检测赭曲霉毒素A和/或制备检测赭曲霉毒素A的免疫检测产品中的应用。在本专利技术具体实施方式中，所述免疫检测产品为免疫层析试纸条，更具体地为免疫层析胶体金试纸条。依据上述应用，本专利技术提供了一种检测赭曲霉毒素A的免疫层析试纸条，包括赭曲霉毒素A降解酶-胶体金标记物、IgG-胶体金标记物和试纸条；所述试纸条上的检测线包被有赭曲霉毒素A，所述质控线包被有抗IgG抗体；所述赭曲霉毒素A降解酶具有如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。其中，所述赭曲霉毒素A降解酶-胶体金标记物和IgG-胶体金标记物在实际使用时需将两者混合使用，两者工作时的体积比为1:1；故两者可组成混合试剂，也可分开单独成一种试剂；所述试纸条具备一般免疫层析试纸条的结构，在本专利技术具体实施方式中，所述试纸条包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，三者顺次搭接在基板上，硝酸纤维素膜上标记有检测线和质控线，示意图参见图1；所述基板优选为PVC基板，所述样品垫优选为吸油纸；所述吸水垫优选为吸水纸。在本专利技术具体实施方式中，所述IgG为小鼠IgG，所述抗IgG抗体为羊抗鼠IgG。本专利技术所述免疫层析试纸条经测试，灵敏度在0.01μg/ml；此外，同时检测赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素M1、T-2毒素、伏马毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A，所述免疫层析试纸条只有赭曲霉毒素A检测线出现消线，为阳性，说明本专利技术所述免疫层析试纸条对赭曲霉毒素A具有较高的特异性。基于此，本专利技术提供了所述免疫层析试纸条在检测赭曲霉毒素A中的应用。同时，本专利技术提供了所述免疫层析试纸条的制备方法，包括：制备胶体金颗粒，然后分别用权利要求1所述赭曲霉毒素A降解酶和IgG与胶体金颗粒偶联，获得赭曲霉毒素A降解酶-胶体金标记物以及IgG-胶体金标记物；将赭曲霉毒素A包被在硝酸纤维素膜上作为检测线，将抗IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上作为质控线；将样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次搭接在背板上组装成试纸条。其中，所述胶体金颗粒用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成40nm胶体金颗粒的方法制备获得；然后制备的40nm胶体金颗粒2mL调节pH至8.0，加入3μg赭曲霉毒素A降解酶，然后快速混匀3D旋转仪上混匀30min，然后加入终浓度1％BSA3D旋转混合仪上混匀30min，12000rpm离心10min，用硼酸盐缓冲液0.1mL重悬，得到稳定的赭曲霉毒素A降解酶-胶体金标记物；将上述步骤中的赭曲霉毒素A降解酶替换为IgG，即可得到IgG-胶体金标记物；在本专利技术具体实施方式中，所述检测线包被有赭曲霉毒素A-BSA偶联物。具体为，将赭曲霉毒素A-BSA偶联物用0.01MPBS稀释至2mg/ml，利用胶体金喷金划膜仪在硝酸纤维素膜上划线作为检测线，将抗IgG抗体用0.01MPBS稀释至1mg/ml利用胶体金喷金划膜仪在硝酸纤维素膜上划线作为质控线，37℃烘箱烘干，获得硝酸纤维素膜。所述赭曲霉毒素A-BSA偶联物采用NHS法制备。由以上技术方案可知，本专利技术利用所述赭曲霉毒素A降解酶特异性结合赭曲霉毒素A的特性制作胶体金免疫层析试纸条，与赭曲霉毒素A具有更高的亲和力，灵敏度高；具有更强的特异性，与其他毒素无交叉；且受体可以体外原核表达，与抗体相比较具有产量高，周期短，成本低的优势，且整个过程可控；免疫层析试纸条检测赭曲霉毒素A时无需任何其他试剂，加入处理后的样品液后，5-10min即可获得结果，大大提高效率，可实现赭曲霉毒素A的现场快速检测。附图说明图1所示为本专利技术所述免疫层析试纸条中试纸条的结构示意图；1表示基板，2表示样品垫，3表示硝酸纤维素膜，4表示吸水垫，5表示检测线，6为质控线；图2所示为不同样品采用本专利技术所述免疫层析试纸条检测的显色结果；其中，1-8依次为0ng/mL、0.5ng/mL、1ng/ml、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、1μg/mL赭曲霉毒素A标准品溶液显色结果，9-15依次为1μg/ml的赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素M1、T-2毒素、伏马毒素、玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素B1的溶液和PBS空白对照。具体实施方式本专利技术公开了一种赭曲霉毒素A降解酶及其应用和检测赭曲霉毒素A的免疫层析试纸条，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术所述赭曲霉毒素A降解酶及其应用和免疫层析试纸条已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述赭曲霉毒素A降解酶及其应用和免疫层析试纸条进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。以下就本专利技术所提供的一种赭曲霉毒素A降解酶及其应用和检测赭曲霉毒素A的免疫层析试纸条做进一步说明。实施例1：本专利技术所述赭曲霉毒素A降解酶的获得(1)通过基因合成得到赭曲霉毒素A降解酶序列，以合成的序列为模板设计引物并进行基因扩增，使得到的基因两端引入NdeI/XhoI酶切位点，引物序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种赭曲霉毒素A降解酶，其特征在于，具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种赭曲霉毒素A降解酶，其特征在于，具有如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。2.权利要求1所述赭曲霉毒素A降解酶在检测赭曲霉毒素A和/或制备检测赭曲霉毒素A的免疫检测产品中的应用。3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述免疫检测产品为免疫层析试纸条。4.一种检测赭曲霉毒素A的免疫层析试纸条，其特征在于，包括赭曲霉毒素A降解酶-胶体金标记物、IgG-胶体金标记物和试纸条；所述试纸条上的检测线包被有赭曲霉毒素A，所述质控线包被有抗IgG抗体；所述赭曲霉毒素A降解酶具有如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。5.根据权利要求4所述免疫层析试纸条，其特征在于，所述赭曲霉毒素A降解酶-胶体金标记物和IgG-胶体金标记物的工作时质量比为1:1。6.根据权利要求4或5所述免疫层析试纸条，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：李桂冠，李笑樱，任鋆，郭杰，陈博，
申请(专利权)人：中粮集团有限公司，中粮营养健康研究院有限公司，中粮生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11