一种可高产酪氨酸的大肠杆菌工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种可高产酪氨酸的大肠杆菌工程菌及其应用，属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明专利技术通过敲除大肠杆菌中编码芳香族氨基酸转运蛋白的基因aroP和/或编码酪氨酸特异性转运蛋白的基因tyrP的基础上，同时，在大肠杆菌中表达编码3‑脱氧‑D‑阿拉伯庚酮糖酸‑7‑磷酸(DAHP)合成酶(DS)的基因aroG

【技术实现步骤摘要】
一种可高产酪氨酸的大肠杆菌工程菌及其应用
本专利技术涉及一种可高产酪氨酸的大肠杆菌工程菌及其应用，属于基因工程以及微生物工程

技术介绍
酪氨酸(L-tyrosine，Tyr)是一种人体的条件必需氨基酸，常被用作苯丙酮尿症患者的营养补充剂，多肽类激素、抗生素、L-多巴等医药化工产品的制备原料，以及合成如白藜芦醇、柚皮素、生松素等高附加值酪氨酸衍生物的前体，被广泛应用于食品、饲料、医药、化工等行业。目前，工业上主要由酶法来制备酪氨酸，酶法具有周期短、选择性强、转化率高和分离纯化步骤简单的优点，但是，天然酶活性低和稳定性差等缺点限制了酶法的应用。而与酶法相比，微生物发酵法可以利用生物质原料实现酪氨酸的从头合成，从而降低酪氨酸的生产成本，同时，微生物发酵法在稳定性方面具有明显对的优势。因此，利用微生物发酵法生产酪氨酸以代替酶法具有非常广阔的发展前景。但是，现有的酪氨酸生产菌，如E.coliDPD4193(Olson,M.M.,Templeton,L.J.,Suh,W.,Youderian,P.,Sariaslani,F.S.,Gatenby,A.A.,Dyk,T.K.V.,2007.Productionoftyrosinefromsucroseorglucoseachievedbyrapidgeneticchangestophenylalanine-producingEscherichiacolistrains.ApplMicrobiolBiot.74,1031-1040)、E.coliygdTKO(Santos,C.N.S.,Stephanopoulos,G.,2008.Melanin-basedhigh-throughputscreenforL-tyrosineproductioninEscherichiacoli.AppliedandEnvironmentalMicrobiology.74,1190-1197.)、E.coliF(Juminaga,D.,Baidoo,E.E.K.,Redding-Johanson,A.M.,Batth,T.S.,Burd,H.,Mukhopadhyay,A.,Petzold,C.J.,Keasling,J.D.,2012.ModularEngineeringofL-TyrosineProductioninEscherichiacoli.AppliedandEnvironmentalMicrobiology.78,89-98.)等，酪氨酸产量均较低，仅有0.18g/L、0.59g/L、2.65g/L，这无疑大大阻碍了微生物发酵法生产酪氨酸的工业化进程。因此，急需找到可提高酪氨酸生产菌酪氨酸产量的方法。
技术实现思路
[技术问题]本专利技术要解决的技术问题是得到一种酪氨酸产量提高的酪氨酸生产菌。[技术方案]为解决上述问题，本专利技术提供了一种可高产酪氨酸的大肠杆菌工程菌，所述大肠杆菌工程菌敲除了编码芳香族氨基酸转运蛋白的基因aroP和/或编码酪氨酸特异性转运蛋白的基因tyrP。在本专利技术的一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌在敲除了编码芳香族氨基酸转运蛋白的基因aroP和/或编码酪氨酸特异性转运蛋白的基因tyrP的基础上，表达了编码3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合成酶(DS)的基因aroGfbr和/或编码分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶(CM-PD)的基因tyrAfbr。在本专利技术的一种实施方式中，所述aroP的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述tyrP的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述aroGfbr的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述tyrAfbr的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述aroGfbr和/或tyrAfbr是通过与热诱导表达载体pAP-B03质粒组装在大肠杆菌工程菌中进行表达的。在本专利技术的一种实施方式中，所述大肠杆菌工程菌在敲除了编码芳香族氨基酸转运蛋白的基因aroP的基础上，表达了编码3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合成酶(DS)的基因aroGfbr和编码分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶(CM-PD)的基因tyrAfbr。本专利技术还提供了一种生产酪氨酸的方法，所述方法为使用上述一种可高产酪氨酸的大肠杆菌工程菌，将上述一种可高产酪氨酸的大肠杆菌工程菌接种至发酵培养基中进行发酵。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵为将上述一种可高产酪氨酸的大肠杆菌工程菌接种至发酵培养基中培养至OD600＝23～27后，将温度控制在36～40℃进行诱导。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵为将上述一种可高产酪氨酸的大肠杆菌工程菌接种至发酵培养基中培养至OD600＝23～27后，将温度控制在38℃进行诱导。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含葡萄糖35g/L、(NH4)2SO45g/L、KH2PO43g/L、MgSO4·7H2O3g/L、NaCl1g/L、柠檬酸钠1.5g/L、CaCl2·2H2O0.015g/L、CaCO312g/L、FeSO4·7H2O0.1125g/L、维生素B10.075g/L、蛋白胨4g/L、酵母粉2g/L、硫酸卡那霉素0.04g/L以及微量元素营养液(TES)1.5mL/L；所述微量元素营养液(TES)的成分包含Al2(SO4)3·18H2O2.0g/L、CoSO4·7H2O0.75g/L、CuSO4·5H2O2.5g/L、H3BO30.5g/L、MnSO4·H2O24g/L、Na2MoO4·2H2O3.0g/L、NiSO4·6H2O2.5g/L、ZnSO4·7H2O15g/L。本专利技术还提供了上述一种可高产酪氨酸的大肠杆菌工程菌或上述方法在制备酪氨酸方面的应用。[有益效果](1)本专利技术通过敲除大肠杆菌中编码芳香族氨基酸转运蛋白的基因aroP和/或编码酪氨酸特异性转运蛋白的基因tyrP的基础上，同时，在大肠杆菌中表达编码3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合成酶(DS)的基因aroGfbr和/或编码分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶(CM-PD)的基因tyrAfbr，大大提高了大肠杆菌的酪氨酸产量；利用本专利技术的大肠杆菌工程菌诱导发酵46h，可使发酵液中酪氨酸的含量高达44.5g/L，较大肠杆菌HGXP提高了57％；(2)本专利技术的菌株使用了热诱导表达载体pAP-aroGfbr-tyrAfbr，相较于其他需要添加价格昂贵的诱导剂的工程菌株，本专利技术的菌株可通过热诱导表达目的基因来生产酪氨酸，具有经济节约且不易染菌的优点，更适合进行工业上的大规模生产。附图说明图1：温度对大肠杆菌工程菌HGXP、HGPP或HGEP酪氨酸产量的影响。图2：大肠杆菌HGPP的补料分批发酵曲线。图3：大肠杆菌HGEP的补料分批发酵曲线。具体实施方式下述实施例中涉及的大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌JM109以及大肠杆菌WSH-Z06(pAP-B03)购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其中，大肠杆菌WSH-Z06(pAP-B03)的保藏编号为CCTCCNo：M2010009。下述实施例中涉及的pAP-B03质粒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可高产酪氨酸的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌敲除了编码芳香族氨基酸转运蛋白的基因aroP和/或编码酪氨酸特异性转运蛋白的基因tyrP。

【技术特征摘要】
1.一种可高产酪氨酸的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌敲除了编码芳香族氨基酸转运蛋白的基因aroP和/或编码酪氨酸特异性转运蛋白的基因tyrP。2.如权利要求1所述的一种可高产酪氨酸的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌在敲除了编码芳香族氨基酸转运蛋白的基因aroP和/或编码酪氨酸特异性转运蛋白的基因tyrP的基础上，表达了编码3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合成酶(DS)的基因aroGfbr和/或编码分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶(CM-PD)的基因tyrAfbr。3.如权利要求1或2所述的一种可高产酪氨酸的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述aroP的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。4.如权利要求1-3任一所述的一种可高产酪氨酸的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述tyrP的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。5.如权利要求2-4任一所述的一种可高产酪氨酸的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述aroGfbr的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。6.如权利要求2-5任一所述的一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：周景文，陈坚，王钦，堵国成，曾伟主，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32