一种基于Au@NiFe MOFs的双猝灭竞争型电致化学发光传感器的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种基于新型纳米材料Au@NiFe MOFs的双重猝灭竞争型型电致化学发光免疫传感器的制备方法及应用，属于电化学发光传感器领域，首次以纳米多孔Au@NiFe MOFs作为双重猝灭标记物标记抗原，利用Ru(bpy)3

【技术实现步骤摘要】
一种基于Au@NiFeMOFs的双猝灭竞争型电致化学发光传感器的制备方法及应用
本专利技术涉及一种基于Au@NiFeMOFs的双重猝灭竞争型电致化学发光免疫传感器的制备方法及应用。具体涉及纳米材料Ru(bpy)32+/Zr-MOFs和双猝灭剂Au@NiFeMOFs的制备及其在电致化学发光传感器中的应用。利用Au@NiFeMOFs其优良的生物兼容性、大的比表面积、高的孔隙率来增加抗原固载量，且其可以双重猝灭Ru(bpy)32+/Zr-MOFs的发光效应，进而达到了增强传感器灵敏度的目的。本专利技术属于电化学发光检测

技术介绍
己烯雌酚（DES）是一种人工合成的非甾体雌激素物质，能产生与天然雌二醇相同的所有药理与治疗作用。1971年Herbst等人在《新英格兰医学杂志》上正式提出DES与青年女性罕见的阴道腺癌（CCA）之间的关系，因此DES对人体的危害极大。若母体孕期服用过DES，女性胎儿发育至成年怀孕时易于流产，主要因为DES致使子宫畸形；对于男性胎儿来说，由DES引起的症状主要包括：隐睾、睾丸癌、附睾囊肿、不育等。DES作为一种可以促进动物蛋白质合成的雌激素主要存在于猪羊鱼肉等动物性食品中，因此，中华人民共和国农业部第235号公告在修订的《动物性食品中兽药最高残留量》中规定所有食品动物和所有可食组织中DES的最高含量为未检出。故寻找一种可以简便快捷灵敏的DES检测方法有着重要意义。本专利技术中所用的电化学发光方法消耗低、易控制、灵敏度高且检测限低，具有电化学和化学发光两种方法的优势，是一种环境友好型方法。因此本专利技术设计了一种竞争型的电致化学发光免疫分析方法用于己烯雌酚的检测。在本专利技术中，使用一种新型纳米材料Ru(bpy)32+/Zr-MOFs作为电化学发光材料。Zr-MOFs因其多孔性具有较大的比表面积可以负载更多的Ru(bpy)32+，进而增强传感器的发光强度。且首次使用一种新型纳米多孔材料Au@NiFeMOFs作为猝灭剂并引入到电化学发光领域。其中Au纳米粒子和NiFeMOFs都可以猝灭Ru(bpy)32+/Zr-MOFs的发光效应，达到双重猝灭的效果。且Au@NiFeMOFs因为其多孔性具有较大的比表面积可以负载更多的己烯雌酚抗原。如上所述都可以大大增强传感器的灵敏度。本专利技术的原理是基于己烯雌酚标准溶液和己烯雌酚抗体的结合能力大大强于Au@NiFeMOFs标记的己烯雌酚-BSA偶联抗原，随着己烯雌酚标准溶液浓度的变大，和己烯雌酚抗体结合的Au@NiFeMOFs标记偶联抗原就越少，双重猝灭效果减弱，发光强度增强。此外，本专利技术设计的竞争型免疫传感器也为其它雌激素分析物的检测提供了一种新方法。目前基于Au@NiFeMOFs构建双重猝灭竞争型免疫传感器来检测己烯雌酚的方法还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种更简单可靠的基于Au@NiFeMOFs的双重猝灭竞争型电致化学发光免疫传感器的制备方法和应用，实现对雌激素的快速、灵敏、特异、高效检测。本专利技术的技术方案如下：为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：1.纳米材料Ru(bpy)32+/Zr-MOFs标记抗体、Au@NiFeMOFs标记己烯雌酚-BSA偶联抗原孵化物溶液的制备（1）Ru(bpy)32+/Zr-MOFs的制备将30mg~45mg2,2-联吡啶-5,5-二羧酸（BPDC）溶于12mLN,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，加入120μL~360μL三乙胺，然后加入1mL~5mL醋酸，搅拌10min~15min得到有机前驱体溶液，将30mg~50mgZrCl4分散于16mLN,N-二甲基甲酰胺中，搅拌10min~15min得到金属溶液前驱体，将两种前躯体溶液混合于50mL聚四氟乙烯高压反应釜中，70℃~90℃反应24h，离心分离，用N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇分别洗涤数次，35℃真空干燥12h，得到白色固体Zr-MOFs；将18mg~24mgZr-MOFs分散于10mL乙醇溶液中，搅拌5min后和10mL含有Ru(bpy)3Cl2·6H2O（1mg~3mg）的N,N-二甲基甲酰胺溶液混合，80℃~100℃搅拌12h，N,N-二甲基甲酰胺、乙醇分别洗涤数次，35℃真空干燥12h，得到橙黄色固体Ru(bpy)32+/Zr-MOFs；（2）Ru(bpy)32+/Zr-MOFs标记抗体孵化物溶液的制备将10mg的Ru(bpy)32+/Zr-MOFs分散于1mLEDC/NHS溶液中室温震荡反应4h~8h，超纯水洗去多余EDC/NHS，然后分散到1mLpH=7.5的PBS中，加入4μL~6μL、6mg/mL的抗体，4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12h~24h，4℃离心分离，最后分散于pH=7.5的PBS缓冲溶液中，制得0.5mg/mL~5mg/mL的Ru(bpy)32+/Zr-MOFs标记偶联抗体，储存于4℃中备用；（3）纳米多孔材料Au@NiFeMOFs的制备将140mg~160mg六水合氯化镍和260mg~280mg二水合柠檬酸三钠分散于20mL超纯水中磁力搅拌5min，同样将130mg~150mg的铁氰化钾分散于20mL超纯水中磁力搅拌5min，然后将两种溶液混合继续在室温下搅拌8h~12h，离心分离悬浮物，使用超纯水和乙醇分别洗涤2次，35℃真空干燥，得到土黄色纳米多孔NiFeMOFs；将30mg~50mg纳米多孔NiFeMOFs分散在50mL超纯水中，加入1mL~3mL1%~3%的氯金酸溶液，室温下搅拌5min，加入4mg~6mg聚乙烯吡咯烷酮（PVP）抑制金纳米粒子的团聚，然后加入还原剂柠檬酸三钠（70mg~90mg），硼氢化钠（0.5mg~1mg）室温下搅拌8h~12h，溶液慢慢变成紫黑色，离心分离悬浮物，超纯水洗涤至上清液无色，35℃真空干燥12h，得到紫黑色固体Au@NiFeMOFs；（4）Au@NiFeMOFs标记抗原孵化物溶液的制备将8mg~12mg的Au@NiFeMOFs分散到1mLpH=7.5的PBS中，加入4μL~6μL、6mg/mL的抗原，4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12h~24h，4℃离心分离，加入1mL0.5%~0.9%的牛血清白蛋白溶液，4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化2h封闭Au@NiFeMOFs上面的非特异性活性位点，4℃离心分离，最后分散于pH=7.5的PBS缓冲溶液中，制得0.5mg/mL~5mg/mL的Au@NiFeMOFs标记抗原，储存于4℃中备用。2.一种Au@NiFeMOFs的双重猝灭竞争型电致化学发光传感器的制备方法，包括以下步骤：（1）分别用1.0mm、0.3mm、0.05mm的氧化铝抛光粉对直径4mm的玻碳电极做抛光处理，用超纯水冲洗干净；（2）将6µL0.5mg/mL~5mg/mLRu(bpy)32+/Zr-MOFs标记偶联抗体滴涂至电极表面，4℃晾干；（3）将3μL体积分数为1%的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，用pH=7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4℃晾干；（4）将6μL、一定浓度的待测物标准溶液滴加到电极表面，用pH=7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4℃晾干（5）将6μL、0.5mg/mL~5mg/mL的Au@NiFeMOFs标记待测物抗原孵化溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于Au@NiFe MOFs的双重猝灭型电致化学发光免疫传感器的制备方法及应用，其特征在于，步骤如下：（1）Ru(bpy)32+/Zr‑MOFs的制备将30 mg ~ 45 mg 2, 2‑联吡啶‑5, 5‑二羧酸溶于12 mL N, N‑二甲基甲酰胺中，加入120 μL ~ 360 μL三乙胺，然后加入1 mL ~ 5 mL醋酸，搅拌10 min ~ 15 min得到有机前驱体溶液，将30 mg ~ 50 mg ZrCl4分散于16 mL N, N‑二甲基甲酰胺中，搅拌10 min ~ 15 min得到金属溶液前驱体，将两种前躯体溶液混合于50 mL聚四氟乙烯高压反应釜中，70 ℃ ~ 90 ℃反应24 h，离心分离，用N, N‑二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇分别洗涤数次，35 ℃真空干燥12 h，得到白色固体Zr‑MOFs；将18 mg ~ 24 mg Zr‑MOFs分散于10 mL乙醇溶液中，搅拌5 min后和10 mL含有Ru(bpy)3Cl2·6H2O（1 mg ~ 3 mg）的N, N‑二甲基甲酰胺溶液混合，80 ℃ ~ 100 ℃搅拌12 h，N, N‑二甲基甲酰胺、乙醇分别洗涤数次，35 ℃真空干燥12 h，得到橙黄色固体Ru(bpy)32+/Zr‑MOFs；（2）Ru(bpy)32+/Zr‑MOFs标记抗体孵化物溶液的制备将10 mg的Ru(bpy)32+/Zr‑MOFs分散于1 mL EDC/NHS溶液中室温震荡反应4 h ~ 8 h，超纯水洗去多余EDC/NHS，然后分散到1 mL pH = 7.5的PBS中，加入4 μL ~ 6 μL、6 mg/mL的抗体，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12h ~ 24 h，4 ℃离心分离，最后分散于pH = 7.5的PBS缓冲溶液中，制得0.5 mg/mL ~ 5 mg/mL的Ru(bpy)32+/Zr‑MOFs标记偶联抗体，储存于4 ℃中备用；（3）纳米多孔材料Au@NiFe MOFs的制备将140 mg ~ 160 m六水合氯化镍和260 mg ~ 280 mg二水合柠檬酸三钠分散于20 mL超纯水中磁力搅拌5 min，同样将130 mg ~ 150 mg的铁氰化钾分散于20 mL超纯水中磁力搅拌5 min，然后将两种溶液混合继续在室温下搅拌8 h ~ 12 h，离心分离悬浮物，使用超纯水和乙醇分别洗涤2次，35 ℃真空干燥，得到土黄色纳米多孔NiFe MOFs；将30 mg ~ 50 mg纳米多孔NiFe MOFs分散在50 mL超纯水中，加入1 mL ~ 3 mL 1% ~ 3%的氯金酸溶液，室温下搅拌5 min，加入4 mg ~ 6 mg聚乙烯吡咯烷酮抑制金纳米粒子的团聚，然后加入70 mg ~ 90 mg还原剂柠檬酸三钠，0.5 mg ~ 1 mg硼氢化钠，室温下搅拌8 h ~ 12 h，溶液慢慢变成紫黑色，离心分离悬浮物，超纯水洗涤至上清液无色，35 ℃真空干燥12 h，得到紫黑色固体Au@NiFe MOFs；（4）Au@NiFe MOFs标记抗原孵化物溶液的制备将8 mg ~ 12 mg的Au@NiFe MOFs分散到1 mL pH = 7.5的PBS中，加入4 μL ~ 6 μL、6 mg/mL的抗原，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h ~ 24 h，4 ℃离心分离，加入1 mL 0.5% ~ 0.9%的牛血清白蛋白溶液，4 ℃恒温振荡培养箱中振荡孵化2 h封闭Au@NiFe MOFs上面的非特异性活性位点，4 ℃离心分离，最后分散于pH = 7.5的PBS缓冲溶液中，制得0.5 mg/mL ~ 5 mg/mL的Au@NiFe MOFs标记抗原，储存于4 ℃中备用；（5）分别用1.0 mm、0.3 mm、0.05 mm的氧化铝抛光粉对直径4 mm的玻碳电极做抛光处理，用超纯水冲洗干净；（6）将6 µL 0.5 mg/mL ~ 5 mg/mL Ru(bpy)32+/Zr‑MOFs标记偶联抗体滴涂至电极表面，4 ℃晾干；（7）将3 μL体积分数为1%的牛血清白蛋白BSA溶液于电极表面，以封闭电极表面上非特异性活性位点，用pH = 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干；（8）将6 μL、一定浓度的待测物标准溶液滴加到电极表面，用pH = 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，4 ℃晾干（9）将6 μL、0.5 mg/mL ~ 5 mg/mL的Au@NiFe MOFs标记待测物抗原孵化溶液滴加到电极表面，4 ℃晾干，用pH = 7.5的PBS缓冲溶液冲洗，制得一种基于Au@NiFe MOFs的双猝灭竞争型电致化学发光免疫传感器。...

【技术特征摘要】
1.一种基于Au@NiFeMOFs的双重猝灭型电致化学发光免疫传感器的制备方法及应用，其特征在于，步骤如下：（1）Ru(bpy)32+/Zr-MOFs的制备将30mg~45mg2,2-联吡啶-5,5-二羧酸溶于12mLN,N-二甲基甲酰胺中，加入120μL~360μL三乙胺，然后加入1mL~5mL醋酸，搅拌10min~15min得到有机前驱体溶液，将30mg~50mgZrCl4分散于16mLN,N-二甲基甲酰胺中，搅拌10min~15min得到金属溶液前驱体，将两种前躯体溶液混合于50mL聚四氟乙烯高压反应釜中，70℃~90℃反应24h，离心分离，用N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇分别洗涤数次，35℃真空干燥12h，得到白色固体Zr-MOFs；将18mg~24mgZr-MOFs分散于10mL乙醇溶液中，搅拌5min后和10mL含有Ru(bpy)3Cl2·6H2O（1mg~3mg）的N,N-二甲基甲酰胺溶液混合，80℃~100℃搅拌12h，N,N-二甲基甲酰胺、乙醇分别洗涤数次，35℃真空干燥12h，得到橙黄色固体Ru(bpy)32+/Zr-MOFs；（2）Ru(bpy)32+/Zr-MOFs标记抗体孵化物溶液的制备将10mg的Ru(bpy)32+/Zr-MOFs分散于1mLEDC/NHS溶液中室温震荡反应4h~8h，超纯水洗去多余EDC/NHS，然后分散到1mLpH=7.5的PBS中，加入4μL~6μL、6mg/mL的抗体，4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12h~24h，4℃离心分离，最后分散于pH=7.5的PBS缓冲溶液中，制得0.5mg/mL~5mg/mL的Ru(bpy)32+/Zr-MOFs标记偶联抗体，储存于4℃中备用；（3）纳米多孔材料Au@NiFeMOFs的制备将140mg~160m六水合氯化镍和260mg~280mg二水合柠檬酸三钠分散于20mL超纯水中磁力搅拌5min，同样将130mg~150mg的铁氰化钾分散于20mL超纯水中磁力搅拌5min，然后将两种溶液混合继续在室温下搅拌8h~12h，离心分离悬浮物，使用超纯水和乙醇分别洗涤2次，35℃真空干燥，得到土黄色纳米多孔NiFeMOFs；将30mg~50mg纳米多孔NiFeMOFs分散在50mL超纯水中，加入1mL~3mL1%~3%的氯金酸溶液，室温下搅拌5min，加入4mg~6mg聚乙烯吡咯烷酮抑制金纳米粒子的团聚，然后加入70mg~90mg还原剂柠檬酸三钠...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵冠辉，曹伟，王耀光，李小建，东雪，李璇，魏琴，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37