基于Ru(bpy)3制造技术

本发明专利技术公开一种基于Ru(bpy)3

【技术实现步骤摘要】
基于Ru(bpy)32+和Bi纳米棒自增强体系的唾液酸可再生电致化学发光传感器
本专利技术属于新型功能材料与生物传感检测
，具体涉及一种基于Ru(bpy)32+和Bi纳米棒自增强体系构建的唾液酸可再生电致化学发光免疫传感器及其分析方法的制备和应用。
技术介绍
细胞表面唾液酸(SA)是临床公认的肿瘤标记物，研究表明SA的过表达与多种疾病有关，比如：心血管疾病、肺癌、白血病和结肠癌。目前，用于检测SA的分析方法有很多，例如，非酶电化学传感器、安培酶传感器、比色传感器等，但这些检测方法有一个共同的缺点，即免疫传感器在每次检测后难以实现再生，需要重新修饰免疫传感层才能进行测量，这使得检测过程变得繁琐、耗时长。因此，开发一种可再生的传感器来检测SA具有重要的意义。电致化学发光免疫传感器，凭借其优异的特性（灵敏度高、特异性好、操作简便、背景低），已经被广泛地应用于临床诊断、药物分析和环境监测等领域。本专利技术构建了一种硼酸亲和型可再生电致化学发光（ECL）免疫传感器检测SA。铋纳米棒（BiNRs）首次作为钌联吡啶（Ru(bpy)32+）的共反应试剂，构成自增强Ru(bpy)32+-BiNRs体系，并以金红石TiO2介晶（N-TiO2）为载体，其大的比表面积和优异的介孔结构为Ru(bpy)32+和BiNRs的负载提供大量的活性位点，最终制备出高效的ECL探针，实现对SA的高灵敏检测。4-巯基苯硼酸（4-MPBA）作为仿生识别分子，在碱性条件下与目标物SA通过共价作用形成稳定的环酯，将SA固定在修饰电极表面，修饰电极与标记有SA抗体的探针连接，可产生强烈的ECL信号。将孵育有ECL探针的修饰电极浸泡在PBS（pH6）溶液中一段时间，硼酸酯解离，迫使SA与ECL探针脱离电极界面，ECL信号大幅度减低，而保留下的传感层仍可继续使用，再次与SA和ECL探针孵育，ECL信号恢复，得到一种可再生的ECL免疫传感器检测SA.基于N-TiO2和BiNRs的信号放大作用，所构建的可再生ECL传感器表现出优异的ECL性能，包括良好的灵敏性、高的稳定性和宽的线性范围。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种以4-MPBA作为分子识别元件，构建硼酸亲和型可再生ECL传感器,并以金红石TiO2介晶（N-TiO2）为载体，负载自增强Ru(bpy)32+-BiNRs体系，提供一种高效的ECL探针及其制备方法。本专利技术的目的之二是将该可再生电致化学发光免疫传感器应用于唾液酸（SA）的高灵敏检测。为实现专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案：1.基于Ru(bpy)32+和Bi纳米棒自增强体系构建的唾液酸可再生电致化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）玻碳电极（GCE）首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，再依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤，得到表面洁净的玻碳电极；（2）取3ul5mg/ml的C60溶液于处理过的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温，得到C60修饰电极；随后，向修饰电极上滴涂3ul5mg/mlTiO2类八面体（TiO2MCs），在红外灯下烘干，待冷却至室温后，得到TiO2MCs/C60修饰电极；（3）滴加3μL4-MPBA于步骤（2）所制得的修饰电极界面，并在室温下孵育40分钟，4-MPBA通过Ti-S键自组装到TiO2MCs/C60修饰电极表面，得到4-MPBA/TiO2MCs/C60修饰电极；（4）取体积比为1:1的5mg/mL金红石TiO2介晶（N-TiO2）溶液与1.0×10-2M钌联吡啶（Ru(bpy)32+）在室温下混合振荡6小时,使N-TiO2表面吸附足够的发光试剂Ru(bpy)32+，离心、洗涤、再分散得到N-TiO2@Ru(bpy)32+复合物；向上述复合物溶液中滴加100μL10mM的4-巯基苯甲酸（4-MBA）并在室温下搅拌1小时,接着，再向所获得的混合溶液中加入200μL5mg/mL的BiNRs，室温振荡40分钟，离心、洗涤、再分散得到N-TiO2@Ru(bpy)32+@BiNRs复合物；随后，将浓度比为2:1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）加入到上述获得的复合溶液中，室温孵育50分钟后，滴加100μL40ng/mL的唾液酸抗体（Ab）于所获得的混合溶液中，室温振荡40分钟,离心，洗涤，再分散制得N-TiO2@Ru(bpy)32+@BiNRs-Ab复合物；最后，向上述复合溶液中滴加50μL1wt%BSA封闭非特异性吸附位点，离心，洗涤，再分散，最终制得N-TiO2@Ru(bpy)32+@BiNRs-Ab-BSA复合物溶液作为电致化学发光探针，储存在4°C冰箱中备用；（5）将步骤（3）制得的4-MPBA/TiO2MCs/C60修饰玻碳电极浸入到不同浓度的唾液酸(SA）标准溶液中并在室温下孵育40分钟，随后，用去离子水冲洗电极表面，制得SA/4-MPBA/TiO2MCs/C60修饰玻碳电极，然后滴加3uL步骤（4）制备的电致化学发光探针（N-TiO2@Ru(bpy)32+@BiNRs-Ab-BSA）复合物溶液于SA/4-MPBA/TiO2MCs/C60修饰玻碳电极，室温下反应40分钟，用去离子水冲洗电极表面，制得N-TiO2@Ru(bpy)32+@BiNRs-Ab-BSA/SA/4-MPBA/TiO2MCs/C60修饰玻碳电极；（6）将步骤（5）制得的N-TiO2@Ru(bpy)32+@BiNRs-Ab-BSA/SA/4-MPBA/TiO2MCs/C60修饰玻碳电极浸入到pH为6PBS溶液中一段时间，SA与4-MPBA形成的硼酸酯键解离，致使SA及与SA连接的ECL探针脱离电极界面，得到pH诱导的自清洁电极。2.上述的金红石TiO2介晶（N-TiO2）由下述方法制备的：将4g十二烷基苯磺酸钠(SDBS)溶解在200mL2.2mol/LHNO3溶液中并在室温下搅拌几分钟，使溶液分散均匀；然后，向上述溶液中加入1mL的异丙氧钛(TIP)，在80°C下搅拌192小时,所得混合溶液离心、洗涤后，在60°C下干燥一夜；接着，再在400°C下煅烧60分钟，去除残留有机物，得到最终产物；所述的TiO2类八面体（TiO2MCs）由下述方法制备的：首先，将200mg锐钛矿型TiO2超声分散在35mL醋酸溶液中，其次，将所得均相溶液转移到100mL四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，在200°C下反应48小时，所得产物经离心、洗涤后，在60°C下干燥12小时，最后，再在400°C下煅烧30分钟，除去残余有机物，得到最终产物；上述的C60溶液由下述步骤配置的，取5mg的C60（足球烯）溶解于1mL的甲苯溶液中获得C60溶液。3.所述的铋纳米棒（BiNRs）由下述方法制备的：将750mg的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和250mg的Bi(NO3)3通过温和加热溶解在25mL甘油和12.5mL乙醇的混合物中；然后，将125mg的硼氢化钠（NaBH4）快速加入到上述混合物中，搅拌1分钟，得到黑色溶液，离心，分别用无水乙醇和去离子水冲洗三次后，将所得产物置于真空干燥箱中干燥4小时，得到最终产物。4.本专利技术上述的方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于Ru(bpy)32+和Bi纳米棒自增强体系构建的唾液酸可再生电致化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1） 玻碳电极（GCE）首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，再依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤，得到表面洁净的玻碳电极；（2） 取3 ul 5 mg/ml 的C60溶液于处理过的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温，得到C60修饰电极；随后，向修饰电极上滴涂3 ul 5 mg/ml TiO2 类八面体（TiO2 MCs），在红外灯下烘干，待冷却至室温后，得到TiO2 MCs/C60 修饰电极；（3） 滴加3 μL 4‑MPBA于步骤（2）所制得的修饰电极界面，并在室温下孵育40 分钟，4‑MPBA通过Ti‑S键自组装到TiO2 MCs/C60修饰电极表面，得到4‑MPBA/TiO2 MCs/C60修饰电极；（4） 取体积比为1:1的5 mg/mL金红石TiO2介晶（N‑ TiO2）溶液与1.0×10‑2 M钌联吡啶（Ru(bpy)32+）在室温下混合振荡6 小时, 使N‑TiO2表面吸附足够的发光试剂Ru(bpy)32+，离心、洗涤、再分散得到N‑TiO2@Ru(bpy)32+复合物；向上述复合物溶液中滴加100 μL 10 mM 的4‑巯基苯甲酸（4‑MBA）并在室温下搅拌1小时, 接着，再向所获得的混合溶液中加入200 μL 5 mg/mL 的Bi NRs，室温振荡40 分钟，离心、洗涤、再分散得到N‑TiO2@Ru(bpy)32+@Bi NRs复合物；随后，将浓度比为2:1的1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）及N‑羟基琥珀酰亚胺（NHS）加入到上述获得的复合溶液中，室温孵育50分钟后，滴加100 μL 40 ng/mL 的唾液酸抗体（Ab）于所获得的混合溶液中，室温振荡40分钟 离心，洗涤，再分散制得N‑TiO2@Ru(bpy)32+@Bi NRs‑Ab复合物； 最后，向上述复合溶液中滴加50 μL 1 wt% BSA 封闭非特异性吸附位点，离心，洗涤，再分散，最终制得N‑TiO2@Ru(bpy)32+@Bi NRs‑Ab‑BSA复合物溶液作为电致化学发光探针，储存在4 °C冰箱中备用；（5）将步骤（3）制得的4‑MPBA/TiO2 MCs/C60修饰玻碳电极浸入到不同浓度的唾液酸 (SA）标准溶液中并在室温下孵育40 分钟，随后，用去离子水冲洗电极表面，制得SA/4‑MPBA/TiO2 MCs/C60修饰玻碳电极，然后滴加3 uL步骤（4）制备的电致化学发光探针（N‑TiO2@Ru(bpy)32+@Bi NRs‑Ab‑BSA）复合物溶液于SA/4‑MPBA/TiO2 MCs/C60修饰玻碳电极，室温下反应40 分钟，用去离子水冲洗电极表面，制得N‑TiO2@Ru(bpy)32+@Bi NRs‑Ab‑BSA/SA/4‑MPBA/TiO2 MCs/C60修饰玻碳电极；（6）将步骤（5）制得的N‑TiO2@Ru(bpy)32+@Bi NRs‑Ab‑BSA/SA/4‑MPBA/TiO2 MCs/C60修饰玻碳电极浸入到pH为6的PBS溶液中一段时间，SA与4‑MPBA形成的硼酸酯键解离，致使SA及与SA连接的ECL探针脱离电极界面，得到pH 诱导的自清洁电极。...

【技术特征摘要】
1.一种基于Ru(bpy)32+和Bi纳米棒自增强体系构建的唾液酸可再生电致化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）玻碳电极（GCE）首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，再依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤，得到表面洁净的玻碳电极；（2）取3ul5mg/ml的C60溶液于处理过的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温，得到C60修饰电极；随后，向修饰电极上滴涂3ul5mg/mlTiO2类八面体（TiO2MCs），在红外灯下烘干，待冷却至室温后，得到TiO2MCs/C60修饰电极；（3）滴加3μL4-MPBA于步骤（2）所制得的修饰电极界面，并在室温下孵育40分钟，4-MPBA通过Ti-S键自组装到TiO2MCs/C60修饰电极表面，得到4-MPBA/TiO2MCs/C60修饰电极；（4）取体积比为1:1的5mg/mL金红石TiO2介晶（N-TiO2）溶液与1.0×10-2M钌联吡啶（Ru(bpy)32+）在室温下混合振荡6小时,使N-TiO2表面吸附足够的发光试剂Ru(bpy)32+，离心、洗涤、再分散得到N-TiO2@Ru(bpy)32+复合物；向上述复合物溶液中滴加100μL10mM的4-巯基苯甲酸（4-MBA）并在室温下搅拌1小时,接着，再向所获得的混合溶液中加入200μL5mg/mL的BiNRs，室温振荡40分钟，离心、洗涤、再分散得到N-TiO2@Ru(bpy)32+@BiNRs复合物；随后，将浓度比为2:1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）加入到上述获得的复合溶液中，室温孵育50分钟后，滴加100μL40ng/mL的唾液酸抗体（Ab）于所获得的混合溶液中，室温振荡40分钟离心，洗涤，再分散制得N-TiO2@Ru(bpy)32+@BiNRs-Ab复合物；最后，向上述复合溶液中滴加50μL1wt%BSA封闭非特异性吸附位点，离心，洗涤，再分散，最终制得N-TiO2@Ru(bpy)32+@BiNRs-Ab-BSA复合物溶液作为电致化学发光探针，储存在4°C冰箱中备用；（5）将步骤（3）制得的4-MPBA/TiO2MCs/C60修饰玻碳电极浸入到不同浓度的唾液酸(SA）标准溶液中并在室温下孵育40分钟，随后，用去离子水冲洗电极表面，制得SA/4-MPBA/TiO2MCs/C60修饰玻碳电极，然后滴加3uL步骤（4）制备的电致化学发光探针（N-TiO2@Ru(bpy)32+@BiNRs-Ab-BSA）复合物溶液于SA/4-MPBA/TiO2MCs/C60修饰玻碳电极，室温下反应40分钟，用去离子水冲洗电极表面，制得N-TiO2@Ru(bpy)32+@BiNRs-Ab-BSA/SA/4-MPBA/TiO2MCs/C60修饰玻碳电极；（6）将步骤（5）制得的...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴宏，房丹丹，张书培，高利红，郑祥钦，衣欢，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：福建,35