一种自组装核酸适配体/蛋白质复合纳米探针、制备方法、试剂盒及其应用技术

本发明专利技术公开了一种自组装核酸适配体/蛋白质复合纳米探针、制备方法、试剂盒及其应用，本发明专利技术将三种DNA探针，其中一种为包含有核酸适配体序列的DNA探针，一种标记有辣根过氧化物酶，进行杂交制得自组装核酸适配体/蛋白质复合纳米探针，采用核酸适配体功能化的磁纳米颗粒作为磁分离固相载体，用于血液中人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞(CCRF‑CEM)的特异性捕获，提升对目标物的捕获效率，与上述自组装核酸适配体/蛋白质复合纳米探针配合使用，检测CCRF‑CEM的线性范围宽、检测限低、精密度和准确度高，可实现对外周血样品中CCRF‑CEM的高灵敏度、高特异性和快速检测，对于白血病的辅助诊断、疗效评估和预后判断具有重大意义。

A self-assembled aptamer/protein composite nanoprobe, its preparation method, kit and Application

The invention discloses a self-assembled nucleic acid adapter/protein composite nanoprobe, a preparation method, a kit and its application. The invention discloses three DNA probes, one of which is a DNA probe containing a sequence of nucleic acid adapters, and the other is a DNA probe labeled with horseradish peroxidase, which is hybridized to prepare a self-assembled nucleic acid adapter/protein composite nanoprobe, using the function of nucleic acid adapter. As a solid phase carrier for magnetic separation, the magnetized magnetic nanoparticles can be used for specific capture of human acute lymphoblastic leukemia T lymphocyte (CCRF CEM) in blood and enhance the capture efficiency of target. The detection of CCRF CEM can be achieved with wide linear range, low detection limit, high precision and accuracy by using the self-assembled nucleic acid aptamer/protein composite nanoprobe. The high sensitivity, specificity and rapid detection of CCRF CEM in peripheral blood samples is of great significance for the auxiliary diagnosis, therapeutic evaluation and prognosis judgement of leukemia.

【技术实现步骤摘要】
一种自组装核酸适配体/蛋白质复合纳米探针、制备方法、试剂盒及其应用
本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及一种自组装核酸适配体/蛋白质复合纳米探针、制备方法、试剂盒及其应用。
技术介绍
目前，自组装，作为一种以可控方式将功能结构单元自发地组织或聚集为多功能材料的有力技术，已被成功用于生物医学中的传感和载药等领域。特别地，基于核酸杂交调控的自组装，因核酸具备结构和功能的多样性，及可程序化设计其序列等优点，使得其在纳米材料的有序构建，核酸、酶活性、重金属离子检测等方面具有广阔的应用前景。近年来，以核酸适配体(Aptamer)作为亲和配体的核酸组装体的构建和应用亦获得了广泛关注。Aptamer是从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的单链寡核苷酸，能够通过分子内折叠形成特定的三维结构，从而与靶物质(如小分子、蛋白质、细胞等)高亲和力、高特异性结合。Aptamer作为“化学家的抗体”，具有分子量小、易于合成与修饰、低成本、高稳定性和序列设计可程序化等优点，作为新一代分子识别探针在生物成像、检测和治疗等领域发挥重要作用。目前的研究表明Aptamer结合无机纳米材料如量子点、金纳米颗粒、石墨烯等，能显著提高此类方法对肿瘤细胞的检测性能。然而，罕见基于Aptamer与蛋白质结合的肿瘤细胞检测策略。白血病是一种起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，又称为“血癌”。白血病的发生发展与遗传因素、电离辐射、营养状况等密切相关，外周血中人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞(CCRF-CEM)的检测对于白血病的辅助诊断、疗效评估和预后判断具有重大意义。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种自组装核酸适配体/蛋白质复合纳米探针，采用自组装方法构建新型的核酸适配体/蛋白质复合纳米探针用于CCRF-CEM的特异性识别和检测信号的双重放大，提高检测的灵敏度和准确性。本专利技术的目的之二在于提供一种自组装核酸适配体/蛋白质复合纳米探针的制备方法。本专利技术的目的之三在于提供一种试剂盒，该试剂盒使用本专利技术自组装核酸适配体/蛋白质复合纳米探针，采用化学发光的原理实现对目标物的检测，检测灵敏度和准确性高。本专利技术的目的之四在于提供一种上述试剂盒在检测人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞的应用。为了实现以上目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种自组装核酸适配体/蛋白质复合纳米探针，由三种DNA探针杂交而成，其中第一种为包含有核酸适配体序列的DNA探针，记为杂交探针1，其核苷酸序列为：5'-ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGAAAAAAAAAAAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'；第二种为标记辣根过氧化物酶的DNA探针，记为杂交探针2，其核苷酸序列为：5'-HRP-AAAAAAAAAATACTCCCCCAGGTGCCCCTCAGACCCTTTTAGT-3'；第三种DNA探针标记为杂交探针3，其核苷酸序列为：5'-GCACCTGGGGGAGTAAAAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'。上述自组装核酸适配体/蛋白质复合纳米探针的制备方法，取杂交探针1、杂交探针2和杂交探针3在室温环境下涡旋杂交，即完成，该复合纳米探针记为SAPPs，上述涡旋杂交时间为1小时。上述涡旋杂交过程为将杂交探针1、杂交探针2和杂交探针3按照一定比例混合，在室温环境下涡旋杂交。其中，杂交探针1主要由两部组成，一部分为特异性识别CCRF-CEM的核酸适配体，用于识别被Sgc8c-MNPs捕获的CCRF-CEM；另一部分能与杂交探针2发生杂交，用于连接杂交探针2，这两部分用一条长为10个A碱基的连接臂相连。杂交探针1能与杂交探针2的前半部分序列杂交，杂交探针2的后半部分序列能与杂交探针3的前半部分序列杂交，杂交探针3的后半部分序列又能与下一个杂交探针2的前半部分杂交，依次类推，最终形成具有双螺旋结构的DNA长链。每条双链上含有至少一个HRP，所形成的SAPPs不仅具有靶向识别功能，还能实现检测信号的双重放大。进一步地，所述核酸适配体/蛋白质复合纳米探针是浓度均为50-250nmol/L的杂交探针1、杂交探针2和杂交探针3杂交制成。优选的，上述核酸适配体/蛋白质复合纳米探针是浓度为75nmol/L的杂交探针1、150nmol/L杂交探针2和150nmol/L杂交探针3杂交制成。一种试剂盒，包括用于捕获目标产物的捕获探针、和上述的自组装核酸适配体/蛋白质复合纳米探针。上述试剂盒还包括目标物捕获载体、化学发光板、洗涤缓冲液、结合缓冲液、化学发光底液。上述试剂盒的应用，应用于外周血中人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞(CCRF-CEM)的检测。进一步地，所述捕获探针的核苷酸序列为：5'-ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGAAAAAAAAAAA-3'。进一步地，所述目标物捕获载体为链霉亲和素磁珠；所述捕获探针负载在链霉亲和素磁珠上，记为Sgc8c-MNPs。上述Sgc8c-MNPs的制备方法为：A：清洗磁珠：采用PBS缓冲液对链霉亲和素磁珠进行清洗；B：链霉亲和素磁珠与捕获探针的结合：在清洗后的链霉亲和素磁珠中加入捕获探针，混合均匀，室温下涡旋反应后磁分离，获得磁珠，并采用PBS缓冲液清洗磁珠，即为Sgc8c-MNPs；C：保存磁珠：将步骤B制备的Sgc8c-MNPs重悬于免疫磁珠保存液中，4℃下储存备用。进一步地，上述试剂盒的应用，其检测方法包括以下操作步骤：(1)洗涤低吸附离心管：采用洗涤缓冲液清洗低吸附离心管；(2)加Sgc8c-MNPs：用洗涤缓冲液洗涤Sgc8c-MNPs3次，并重悬于相同体积的洗涤缓冲液中，每管20μL加入低吸附离心管中，再用洗涤缓冲液洗涤；(3)加待检测样品：在步骤(2)处理后的低吸附离心管中加入一定体积的待检测样品，孵育，磁分离，弃上清，用洗涤缓冲液洗涤；(4)将步骤(3)得到的待检测样品和Sgc8c-MNPs复合物重悬于结合缓冲液中，转移至化学发光板中，磁分离，弃上清；(5)将SAPPs加入化学发光板中，4℃孵育20min，磁分离，弃上清，用洗涤缓冲液洗板；(6)在化学发光板每孔中加入化学发光底液，用微孔板式发光检测仪检测RLU；(7)按照上述步骤(1)至(6)同样的方法检测不同浓度的CCRF-CEM标准品的RLU，绘制出RLU与CCRF-CEM浓度之间关系的标准曲线图，得出RLU与CCRF-CEM浓度之间的关系式，然后将步骤(6)中待检测样品的RLU带入该关系式，即可计算出待检测样品中CCRF-CEM的浓度。进一步地，上述步骤(6)中化学发光底液包括化学发光底液A和化学发光底液B，其中化学发光底液A为鲁米诺和增强剂(对羟基联苯，BIP)，化学发光底液B为双氧水溶液。进一步地，上述洗涤缓冲液的组成为0.01mol/LpH7.4PBS，4.5mg/mL葡萄糖，5mmol/LMgCl2·6H2O，0.05％Tween-20；结合缓冲液的组成为0.01mol/LpH7.4PBS，4.5mg/mL葡萄糖，5mmol/LMgCl2·6H2O，0.1mg/mLyeasttRNA，0.05％Tween-20。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：本专利技术将三种本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种自组装核酸适配体/蛋白质复合纳米探针，其特征在于，由三种DNA探针杂交而成，其中第一种为包含有核酸适配体序列的DNA探针，记为杂交探针1，其核苷酸序列为：5'‑ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGAAAAAAAAAAAACTAAAAGGGTCTGAGGG‑3'；第二种为标记辣根过氧化物酶的DNA探针，记为杂交探针2，其核苷酸序列为：5'‑HRP‑AAAAAAAAAATACTCCCCCAGGTGCCCCTCAGACCCTTTTAGT‑3'；第三种DNA探针标记为杂交探针3，其核苷酸序列为：5'‑GCACCTGGGGGAGTAAAAACTAAAAGGGTCTGAGGG‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种自组装核酸适配体/蛋白质复合纳米探针，其特征在于，由三种DNA探针杂交而成，其中第一种为包含有核酸适配体序列的DNA探针，记为杂交探针1，其核苷酸序列为：5'-ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGAAAAAAAAAAAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'；第二种为标记辣根过氧化物酶的DNA探针，记为杂交探针2，其核苷酸序列为：5'-HRP-AAAAAAAAAATACTCCCCCAGGTGCCCCTCAGACCCTTTTAGT-3'；第三种DNA探针标记为杂交探针3，其核苷酸序列为：5'-GCACCTGGGGGAGTAAAAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'。2.一种如权利要求1所述自组装核酸适配体/蛋白质复合纳米探针的制备方法，其特征在于，取杂交探针1、杂交探针2和杂交探针3在室温环境下涡旋杂交，即完成，该复合纳米探针记为SAPPs。3.一种试剂盒，其特征在于，包括用于捕获目标产物的捕获探针、和如权利要求1所述的自组装核酸适配体/蛋白质复合纳米探针。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括目标物捕获载体、化学发光板、化学发光底液、洗涤缓冲液、结合缓冲液。5.一种如权利要求3或4所述试剂盒的应用，其特征在于，应用于外周血中人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞的检测。6.根据权利要求5所述试剂盒的应用，其特征在于，所述捕获探针的核苷酸序列为：5'-ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGAAAAAAAAAAA-3'。7.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：何磊良，邓猛聪，赵梦瑶，沙吉旦·布拉了，高宁振，刘焕，岳帅，汪俊，朱星晨，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南,41