一种基于银纳米簇猝灭效应和多重放大技术的电化学发光生物传感器及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于银纳米簇双重猝灭效应和多重循环放大技术的电化学发光生物传感器及其制法和应用。本发明专利技术的技术方案是通过适体的特异性识别作用，目标ATP与适体结合后打开颈环，暴露出可以与模板DNA结合的序列，在聚合酶和剪切酶的作用下实现多重循环放大反应，生成大量DNA产物链。同时，在DNA模板原位合成的Ag NCs通过循环产物DNA链接到电极上，由于电极上CdS量子点与Ag NCs与之间的ECL共振能量转移以及Ag NCs对电极表面附近的共反应剂的消耗，实现了对电极上ECL信号的双重猝灭，根据ECL信号的变化对ATP进行超灵敏检测。

An electrochemiluminescent biosensor based on quenching effect of silver nanoclusters and multiple amplification technology and its application

The invention discloses an electrochemiluminescent biosensor based on dual quenching effect of silver nanoclusters and multiple cyclic amplification technology, and its preparation method and application. The technical scheme of the invention is to open the neck ring after the target ATP binds to the aptamer, expose the sequence that can bind to the template DNA, realize multiple cyclic amplification reaction under the action of the polymerase and the shearing enzyme, and generate a large number of DNA product chains. At the same time, Ag NCs synthesized in situ from DNA template are linked to the electrode through cyclic product DNA. Due to the resonance energy transfer between CdS quantum dots and Ag NCs on the electrode and the consumption of co-reactants near the electrode surface by Ag NCs, the dual quenching of ECL signals on the electrode is realized, and the ATP is supersensitive detected according to the change of ECL signals.

【技术实现步骤摘要】
一种基于银纳米簇猝灭效应和多重放大技术的电化学发光生物传感器及其应用
：本专利技术涉及一种基于银纳米簇双重猝灭效应和多重循环放大技术的电化学发光生物传感器；本专利技术还涉及所述生物传感器的制备方法及其检测ATP的分析应用。
技术介绍
：三磷酸腺苷(ATP)是一种多功能的生物分子，源源不断地为细胞的各项生命活动提供所需要的能量[KnowlesJR.AnnualReviewofBiochemistry,2003,49(1):877-919.]、[ChenJ,LiuY,JiX,etal.Biosensors&Bioelectronics,2016,83:221-228.]、[FuP,SunM,XuL,etal.Nanoscale,2016,8(32):15008-15015.]。研究证明，ATP可以作为一项生化指标，不同浓度的ATP和心血管疾病，细胞活力和细胞损伤，帕金森病和阿尔茨海默病有着密切的联系[LiX,PengY,ChaiY,etal.ChemicalCommunications,2016,52(18):3673-3676.]、[LuL,JingCS,ZhongFG,etal.Biosensors&Bioelectronics,2015,63:14-20.]，开发出灵敏的ATP识别检测方法具有重要的意义。电致化学发光(ECL)作为一种强大的分析技术，由于其具有高灵敏度，低背景，操作简单和优异的可控性等优点而受到越来越多的关注[LiuY,LeiJ,HuangY,etal.AnalyticalChemistry,2014,86(17):8735-8741.]、[MaW,XuL,deMouraAF,etal.ChemicalReviews,2017,117(12):8041-8093.]，并且被应用于多种生物标志物检测中。与此同时，许多具有较强发光性能和良好的电化学稳定性的ECL发光材料也不断被开并被应用于生物传感之中，例如鲁米诺[XuL,SunM,MaW,etal.MaterialsToday,2016,19:595–606.]、量子点[RohrbachF,F,FichteMAH,etal.AngewandteChemieInternationalEdition,2013,52(45):11912-11915.]、钌及其衍生物[DengC,ChenJ,NieL,etal.AnalyticalChemistry,2009,81(24):9972-9978.]等。特别是量子点材料，因其较好的生物相容性备受青睐[RohrbachF,F,FichteMAH,etal.AngewandteChemieInternationalEdition,2013,52(45):11912-11915.]。自从2009年CdS:Mn和银纳米簇在近距离发生ECL共振能量转移[LiuJ,CaoZ,LuY.ChemicalReviews,2009,109(5):1948-1998.]，基于ECL共振能量转移的猝灭效应已经证明是一种有效的提高生物传感的方法，比如CdS:Mn激发CdTeNCs[FengC,DaiS,WangL.Biosensors&Bioelectronics,2014,59:64-74.]，CdSNCs-Ru(bpy)32+[ZhaoWW,XuJJ,ChenHY.TracTrendsinAnalyticalChemistry,2016,82:307-315.]，通过对距离的控制也可以实现对ECL信号的增强。银纳米簇(AgNCs)因其自身独特的光学、电学、化学特性已经引起了相关领域广泛的研究兴趣[ShanY,XuJJ,ChenHY.Chem.Commun.2010,46(28),5079-5081.]，银离子对胞嘧啶的高效亲和力使得银离子可以结合到富C的ssDNA上，DNA成为较好的支撑AgNCs的骨架而被广泛应用。最近的报道发现，以ssDNA为模板合成的AgNCs的紫外-可见光谱在492nm处有吸收峰[WuMS,ShiHW,XuJJ,etal.ChemicalCommunications,2011,47(27):7752-7754.]，AgNCs可能是CdS量子点的能量受体之一。这种纳米团簇通常由数个到数十个原子组成，其尺寸小于2nm，并具有尺寸依赖性的离散能级，这可能使其具有类似于分子的催化性能[ChengY,LeiJ,ChenY,etal.Biosensors&Bioelectronics,2014,51(1):431-436.]。基于以上原则，可以设计一种基于AgNCs的ECL-RET和电子转移ECL传感体系。等温指数扩增反应(EXPAR)作为核酸最重要的扩增策略之一，因其本身简单的扩增形式和相对高的扩增效率而成为一种很有前途的方法[LiJ,ZhuJJ,XuK.TracTrendsinAnalyticalChemistry,2014,58:90-98.]。通过巧妙地设计了两阶段的扩增，该模板可以快速将打开的颈环链与ATP分子转换成无ATP分子的新DNA，进而在产生产物时又可以诱导出下一个高效的EXPAR，从而进一步提高了检测的灵敏度。本专利技术设计了一种基于AgNCs双重猝灭效应和多重循环放大技术的电化学发光生物传感器，利用ECL共振能量转移和AgNCs的在线还原，实现了对ATP的超灵敏检测。通过适体的特异性识别作用，当目标ATP与其适体结合后打开颈环，暴露出可以与模板DNA结合的序列，在聚合酶和剪切酶的作用下实现多重循环放大反应，生成大量DNA产物链。同时，在DNA模板原位合成的AgNCs通过循环产物DNA链接到电极上，由于电极上CdS量子点与AgNCs与之间的ECL共振能量转移以及AgNCs对电极表面附近的共反应剂的消耗，实现了对电极上ECL信号的双重猝灭，根据ECL信号的变化对ATP进行超灵敏检测。
技术实现思路
：本专利技术的目的之一是提供一种ECL发光性能较好的CdS量子点作为探针，为检测提供较稳定的信号来源。具体包括以下步骤：在三口烧瓶中将5mmol的CdCl2·2.5H2O溶解于30mL二次水中，加入20μLMPA，生成白色的沉淀，之后用1.0M的NaOH调节溶液的pH为10～11，此过程中溶液的沉淀逐渐溶解，接着通氮气除氧30min，然后将新配制的0.02M的Na2S溶液20mL溶液逐滴加入上述反应溶液中，得到橙黄色的沉淀，继续通氮气，保持反应温度在70℃，反应3h之后停止加热，即得羧基修饰的CdS量子点，待反应液自然冷却至室温之后收集置于4℃备用。本专利技术的目的之二是提供一种基于AgNCs双重猝灭效应和多重循环放大技术的电化学发光生物传感器，实现了对ATP的超灵敏检测。它由以下步骤组成：生物传感器的制备：步骤1.传感器的构建：取10μL制备的CdS量子点溶液均匀地滴在电极表面，室温下自然晾干，即得CdS修饰的金电极；接下来，将电极浸入含有EDC(20mg/mL)和NHS(10mg/mL)的溶液中，进行量子点表面羧基的活化处理1h；之后用PBS轻轻冲洗电极表面，以除去残余的EDC和NHS，然后将10μL的HP2(1μM)滴到电极的表面，在湿润的环境下避光反应4h；用PBS本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于银纳米簇双重猝灭效应和多重循环放大技术的电化学发光生物传感器，其特征是：通过目标ATP与其适体结合以及酶聚合剪切作用实现多重循环放大反应，生成大量DNA产物链，将原位合成Ag NCs的DNA接到电极上，实现电极上CdS量子点与Ag NCs与之间的ECL能量转移以及Ag NCs对电极表面附近的共反应剂的消耗，从而构建电化学发光生物传感器。

【技术特征摘要】
1.一种基于银纳米簇双重猝灭效应和多重循环放大技术的电化学发光生物传感器，其特征是：通过目标ATP与其适体结合以及酶聚合剪切作用实现多重循环放大反应，生成大量DNA产物链，将原位合成AgNCs的DNA接到电极上，实现电极上CdS量子点与AgNCs与之间的ECL能量转移以及AgNCs对电极表面附近的共反应剂的消耗，从而构建电化学发光生物传感器。2.一种制备权利要求1所述的基于银纳米簇双重猝灭效应和多重循环放大技术的电化学发光生物传感器的方法和应用，其特征方法由下列步骤组成：步骤1.CdS量子点的制备：采用水热合成方法合成了CdS量子点作为信号材料，在三口烧瓶中将5mmol的CdCl2·2.5H2O溶解于30mL二次水中，加入20μLMPA，生成白色的沉淀，之后用1.0M的NaOH调节溶液的pH为10～11，此过程中溶液的沉淀逐渐溶解，接着通氮气除氧30min，然后将新配制的0.02M的Na2S溶液20mL溶液逐滴地加入上述反应溶液中，得到橙黄色的沉淀，继续通氮气，保持反应温度在70℃，反应3h之后停止加热，即得羧基修饰的CdS量子点，待反应液自然冷却至室温之后收集置于4℃备用。步骤2.目标引发酶辅助循环放大反应：首先配制一定浓度梯度的ATP溶液，为10pM，1pM，100fM，10fM，1fM，100aM，10aM，1aM，0.1aM的目标物溶液，置于4℃备用。然后，分别几个在反应管中加入10μL(1μM)HP1，再分别加入10μL各个浓度的ATP，混合均匀之后置于恒温震荡期中反应30min，之后，在反应管内加入1μM的templateDNA链10μL，10μL的dNTPs，5Uphi29聚合酶和5UNt.BbvCI内切酶以及各自对应的缓冲液，混合均匀之后在在摇床里37℃温度下反应90min，接下来将反应管放在60℃的水浴环境中进行酶的灭活，最后置于4℃备用。步骤3银纳米簇的制备：先配置0.02M的AgNO3的溶液，按照DNA与Ag+比例为1:10的比例将200μL的10μM的银序列与1μL的Ag...

【专利技术属性】
技术研发人员：接贵芬，葛君君，王卫，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：山东,37