本发明专利技术公开一种基于NiFe2O4纳米管催化增强的卵巢癌标志物比率型电致化学发光传感平台，特点是在NiFe2O4纳米管和h‑BN上，分别引入Envision复合物和lucigenin。NiFe2O4纳米管不仅可以承载大量Envision复合物，而且能够催化析氧反应过程释放氧气，引发2‑(二丁基氨基)乙醇的阳极发光；h‑BN可以固载大量lucigenin并且保持其在碱性条件下的发光稳定性；富含辣根过氧化物酶的Envision复合物催化H2O2产生超氧自由基，同时增强两种发光信号。因此，所制得的比率免疫传感器，具有灵敏度高、检测限低等优点，用于人附睾蛋白4的检测，在早期卵巢癌诊断和监控方面具有较为重要的价值。
【技术实现步骤摘要】
一种基于NiFe2O4纳米管催化增强的卵巢癌标志物比率型电致化学发光传感平台
本专利技术属于新型功能材料与免疫传感检测
，具体涉及一种基于NiFe2O4纳米管催化增强的卵巢癌标志物比率型电致化学发光传感平台的免疫分析方法及应用。
技术介绍
比率法，一种新的分析方法，其量化取决于两信号的比率而不是绝对值，已经逐步被应用在荧光、电化学发光、光电和电化学等领域，相比其他分析技术，电致化学发光（ECL）因其灵敏度高、反应可控性强、仪器设备简单等优点引起了广泛的关注，其与比率型分析技术的结合为生物传感器的发展提供了更加广阔的应用前景。电致化学发光免疫传感器，利用抗原与抗体之间特异性结合的一类生物传感器，具有灵敏度高、选择性好、操作简便、易于小型化、可连续快速、自动化检测分析等优点，具有良好的应用前景。本专利技术制备了一种基于NiFe2O4纳米管催化增强的传感平台及其对卵巢癌标志物的比率电致化学发光免疫分析方法，实现了对卵巢癌标志物，人附睾蛋白4（HE4）的高灵敏检测。NiFe2O4纳米材料，作为逆尖晶石结构氧化物的代表，由于其高地球丰度、环境友好性、高导电性和长期稳定性，在电子/电子器件和催化领域得到了广泛关注。其中，NiFe2O4纳米管，因其大的比表面积和良好的催化性能，使其成为催化析氧反应的理想材料，在光电化学传感领域具有广阔的应用前景。六方氮化硼纳米片（h-BN），因其特殊的片状结构、优异的力学性能、热稳定性和化学稳定性以及良好的耐腐蚀性能，在电化学发光领域备受关注。Envision复合物是一种由许多抗体和辣根过氧化物酶(HRP)偶联到右旋糖酐骨架上的新型聚合物，表面具有较多的活性位点，并且表现出良好的催化性能，在构建良好的电化学传感器中得到了广泛关注。本专利技术基于NiFe2O4纳米管（NiFe2O4NTs）和六方氮化硼纳米片（h-BN），分别引入Envision复合物和光泽精（lucigenin）。首先，NiFe2O4NTs不仅可以承载大量Envision复合物，而且能够催化析氧反应（OER）过程释放氧气，引发2-(二丁基氨基)乙醇（DBAE）的阳极发光；其次，具有强耐腐蚀性的h-BN可以固载大量lucigenin并且保持其在碱性条件下的发光稳定性；此外，富含辣根过氧化物酶的Envision复合物催化H2O2产生超氧自由基（O2•−），同时增强两种发光信号。因此，所制得的比率免疫传感器，具有灵敏度高、检测限低等优点，用于人附睾蛋白4（HE4）的检测，在早期卵巢癌诊断和监控方面具有非常重要的价值。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是基于NiFe2O4纳米管（NiFe2O4NTs）和六方氮化硼纳米片（h-BN）作为传感平台，2-(二丁基氨基)乙醇（DBAE）和光泽精（lucigenin）作为电致化学发光对，构建一种稳定性好，灵敏度高的比率型电致化学发光免疫传感器。本专利技术的目的之二是将该比率型电致化学发光免疫传感器应用于卵巢癌新型标志物，人附睾蛋白4（HE4）的高灵敏检测。为实现专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案：1.一种基于NiFe2O4纳米管催化增强的卵巢癌标志物比率型电致化学发光传感平台的制备方法，其特点在于，包括以下步骤：（1）玻碳电极（GCE）首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；（2）取40μL摩尔浓度比为4:1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）混合液加入到80μL浓度为4.2μg/mL的抗体（Ab1）溶液中，4ºC下震荡40min，以达到活化羧基的目的；将80μLEnvision复合物溶液加入到上述混合溶液中，室温震荡50min，以完成酰胺反应，从而得到Envision-Ab1复合物溶液；取200μL上述复合物加入200μL浓度为1mg/mLNiFe2O4NTs，在室温下反应4h，后经洗涤、离心、再分散，最终制得NiFe2O4NTs/Envision-Ab1复合物；滴加3μL上述所得NiFe2O4NTs/Envision-Ab1复合物悬浮液于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温，制得Ab1-Envision/NiFe2O4NTs修饰玻碳电极；（3）将步骤（2）制备的修饰玻碳电极置于浓度为1.0wt.%的BSA溶液中孵育30min，以封闭电极界面上非特异性结合位点，用去离子水冲洗电极表面洗去物理吸附，并保存在4°C冰箱中备用；（4）将步骤（3）获得的修饰电极浸入不同浓度的人附睾蛋白4（HE4）标准溶液中并在4°C冰箱中孵育50min，用去离子水冲洗电极表面，制得HE4/Ab1-Envision/NiFe2O4NTs修饰玻碳电极，并保存在4°C冰箱中备用；（5）将200μL浓度为1mM的光泽精（lucigenin）与200μL浓度为5mg/mL六方氮化硼纳米片（h-BN）混合，室温震荡3h，经洗涤、离心、再分散制得h-BN@lucigenin复合物；然后将80mL浓度为10mM的1-氨基芘（AP）加入到上述复合物溶液中，在室温下混合震荡6h，以完成π-π堆叠反应，经洗涤、离心去除过量1-氨基芘，制得氨基化的h-BN@lucigenin复合物；随后，在5wt.%戊二醛（GLD）的辅助作用下加入80μL二抗（Ab2），在室温下震荡30min，经离心、洗涤、再分散制得h-BN@lucigenin@Ab2生物复合物溶液，然后在上述溶液中加入1%BSA封闭非特异性吸附位点，储存在4°C冰箱中备用；（6）取3μL步骤（5）制得的h-BN@lucigenin@Ab2生物复合物溶液于步骤（4）制备的修饰电极界面，并在4ºC下孵育40min，用去离子水冲洗电极表面，制得h-BN@lucigenin@Ab2/HE4/Ab1-Envision/NiFe2O4NTs修饰玻碳电极,并保存在4°C冰箱中备用。2.上述NiFe2O4纳米管（NiFe2O4NTs）由下述方法制备的：将2.4g氯化铁，1.28g硝酸镍和2.2g对苯二甲酸加入到132mLN,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液中震荡10min；随后，将28mL0.4mol/L氢氧化钠溶液逐滴加入到上述混合液，混合均匀后转移至200mL反应釜中，在124°C下加热24h；待反应物冷却后用超纯水和乙醇离心、洗涤数次，最后，将所得产物在450°C下以1ºCmin-1煅烧4h，自然冷却即可。3.上述六方氮化硼纳米片（h-BN）由下述方法制备的：将10mg块状六方氮化硼分散于10mL乙醇中，再加入1mL浓度为0.4mol/L氢氧化钠浓溶液；震荡10min之后将上述混合物转移至反应釜中，在180°C下反应24h；待反应物冷却至室温，用0.22μm微孔膜进行真空过滤，获得白色沉淀物；再将上述白色沉淀分散于水中，超声30min后，离心吸取白色悬浮液，在3500da透析袋中透析至中性；最终将白色悬浮液冷冻干燥，获得六方氮化硼纳米片（h-BN）。4.上述NiFe2O4NTs/Envision-Ab1复合物溶液由下述方法制备的：取40μL摩尔浓度比为4:1的（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）（EDC）及N-羟基琥珀本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于NiFe2O4纳米管催化增强的卵巢癌标志物比率型电致化学发光传感平台的制备方法，其特点在于，包括以下步骤：（1） 玻碳电极（GCE）首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；（2）取40 μL摩尔浓度比为4:1的1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）及N‑羟基琥珀酰亚胺（NHS）混合液加入到80 μL 浓度为4.2 μg/mL的抗体（Ab1）溶液中，4 ºC下震荡40 min，以达到活化羧基的目的；将80 μL Envision 复合物溶液加入到上述混合溶液中，室温震荡50 min，以完成酰胺反应，从而得到Envision‑Ab1复合物溶液；取200 μL上述复合物加入200 μL 浓度为1 mg/mL NiFe2O4纳米管（NiFe2O4 NTs），在室温下反应4 h，后经洗涤、离心、再分散，最终制得NiFe2O4 NTs/Envision‑Ab1复合物；滴加3 μL上述所得NiFe2O4 NTs/Envision‑Ab1复合物悬浮液于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温，制得Ab1‑Envision/NiFe2O4 NTs修饰玻碳电极；（3）将步骤（2）制备的修饰玻碳电极置于浓度为1.0 wt.%的BSA溶液中孵育30 min，以封闭电极界面上非特异性结合位点，用去离子水冲洗电极表面洗去物理吸附，并保存在4°C冰箱中备用；（4）将步骤（3）获得的修饰电极浸入不同浓度的人附睾蛋白4（HE4）标准溶液中并在4°C冰箱中孵育50 min，用去离子水冲洗电极表面，制得HE4/Ab1‑Envision/NiFe2O4 NTs修饰玻碳电极，并保存在4 °C冰箱中备用；（5）将200 μL浓度为1 mM的光泽精（lucigenin）与200 μL浓度为5 mg/mL六方氮化硼纳米片（h‑BN）混合，室温震荡3 h，经洗涤、离心、再分散制得h‑BN@lucigenin复合物溶液；然后将80 mL 浓度为10 mM的1‑氨基芘（AP）加入到上述复合物溶液中，在室温下混合震荡6 h，以完成π‑π堆叠反应，经洗涤、离心去除过量1‑氨基芘，制得氨基化的h‑BN@lucigenin复合物；随后，在5 wt.%戊二醛（GLD）的辅助作用下加入80 μL二抗（Ab2），在室温下震荡30 min，经离心、洗涤、再分散制得h‑BN@lucigenin@Ab2生物复合物溶液，然后在上述溶液中加入1 % BSA封闭非特异性吸附位点，储存在4°C冰箱中备用；（6）取3 μL步骤（5）制得的h‑BN@lucigenin@Ab2生物复合物溶液于步骤（4）制备的修饰电极界面，并在4 ºC下孵育40 min，用去离子水冲洗电极表面，制得h‑BN@lucigenin@Ab2/HE4/Ab1‑Envision/NiFe2O4 NTs修饰玻碳电极, 并保存在4 °C冰箱中备用。...
【技术特征摘要】
1.一种基于NiFe2O4纳米管催化增强的卵巢癌标志物比率型电致化学发光传感平台的制备方法，其特点在于，包括以下步骤：（1）玻碳电极（GCE）首先在铺有氧化铝粉末的麂皮上机械打磨抛光，用二次水洗去表面残留粉末，再移入超声水浴中清洗，直至清洗干净，最后依序用乙醇，稀酸和水彻底洗涤；（2）取40μL摩尔浓度比为4:1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）混合液加入到80μL浓度为4.2μg/mL的抗体（Ab1）溶液中，4ºC下震荡40min，以达到活化羧基的目的；将80μLEnvision复合物溶液加入到上述混合溶液中，室温震荡50min，以完成酰胺反应，从而得到Envision-Ab1复合物溶液；取200μL上述复合物加入200μL浓度为1mg/mLNiFe2O4纳米管（NiFe2O4NTs），在室温下反应4h，后经洗涤、离心、再分散，最终制得NiFe2O4NTs/Envision-Ab1复合物；滴加3μL上述所得NiFe2O4NTs/Envision-Ab1复合物悬浮液于干净的玻碳电极表面，红外灯下烘干，冷却至室温，制得Ab1-Envision/NiFe2O4NTs修饰玻碳电极；（3）将步骤（2）制备的修饰玻碳电极置于浓度为1.0wt.%的BSA溶液中孵育30min，以封闭电极界面上非特异性结合位点，用去离子水冲洗电极表面洗去物理吸附，并保存在4°C冰箱中备用；（4）将步骤（3）获得的修饰电极浸入不同浓度的人附睾蛋白4（HE4）标准溶液中并在4°C冰箱中孵育50min，用去离子水冲洗电极表面，制得HE4/Ab1-Envision/NiFe2O4NTs修饰玻碳电极，并保存在4°C冰箱中备用；（5）将200μL浓度为1mM的光泽精（lucigenin）与200μL浓度为5mg/mL六方氮化硼纳米片（h-BN）混合，室温震荡3h，经洗涤、离心、再分散制得h-BN@lucigenin复合物溶液；然后将80mL浓度为10mM的1-氨基芘（AP）加入到上述复合物溶液中，在室温下混合震荡6h，以完成π-π堆叠反应，经洗涤、离心去除过量1-氨基芘，制得氨基化的h-BN@lucigenin复合物；随后，在5wt.%戊二醛（GLD）的辅助作用下加入80μL二抗（Ab2），在室温下震荡30min，经离心、洗涤、再分散制得h-BN@lucigenin@Ab2生物复合物溶液，然后在上述溶液中加入1%BSA封闭非特异性吸附位点，储存在4°C冰箱中备用；（6）取3μL步骤（5）制得的h-BN@lucigenin@Ab2生物复合物溶液于步骤（...
【专利技术属性】
技术研发人员：戴宏，高利红，郑红利，衣欢，郑祥钦，张书培，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：福建,35
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