提高红球菌属类微生物生长速度和防止菌种退化的方法技术

本发明专利技术属于微生物发酵领域，涉及提高红球菌属类微生物生长速度和防止菌种退化的方法，具体涉及一种在生物制药和生物去污领域提高菌株生长速度和防止菌株退化的方法。该方法是基于红球菌属内公开的菌种的全基因组序列，发现红球菌属已公开的全基因组序列中均含有相容性物质的生物合成基因簇。通过系列实验，发现通过添加合适浓度的相容性物质，不但可以明显提高菌株对抗不良环境的适应能力及高渗透压的耐受度，维持细菌形态防止菌株退化，还具有促进冻干保藏菌体的萌发速率和菌体的生长速度，缩短发酵周期，使菌株在不良环境下生长速度加快、生物量和遗传稳定性提高的作用。

【技术实现步骤摘要】
提高红球菌属类微生物生长速度和防止菌种退化的方法
本专利技术属于微生物发酵领域，涉及提高红球菌属类微生物生长速度和防止菌种退化的方法，具体涉及一种在生物制药和生物去污领域提高菌株生长速度和防止菌株退化的方法。
技术介绍
红球菌属类微生物在生物制药和治理环境污染方面都有重要的作用。以红球菌属类微生物制备的细胞壁肽聚糖类物质能增强体内巨噬细胞和自然杀伤细胞的免疫活力，具有抑制癌细胞、减少肿瘤复发的功能作用。同时，该类微生物还可作为生物去污的接种介体，可被红球菌属菌株降解、去污的污染物主要有烃类、氯化烃、芳香烃、硝基芳香化合物、多环芳烃化合物、放射性重金属及其聚合物。高渗环境会造成红球菌属在生长过程中发生细胞渗透压失衡、胞内水份外流导致细胞质壁分离，生长速度下降、生长受到抑制，甚至死亡，大大降低了生长存活力；并且会加速菌株的变异，当变异细胞达到一定程度，就会使菌株的某些特性发生改变或丧失，导致菌株的退化。红球菌属类微生物的生长环境中溶液盐浓度增加会导致溶液渗透压的升高，菌体为了维持细胞内外的渗透压，通常会产生相容性物质，该类物质是一类极性的、易溶的并且可以在细胞内高浓度积累同时对细胞主要功能和蛋白质分子正确折叠起到促进作用的小分子物质。相容性物质在嗜盐菌属菌株中广泛存在，然而红球菌属在不良环境胁迫下是否表达或转运相容性物质，表达或转运的相容性物质是否对其具有抗胁迫作用及它们是否具有交互作用，还未见报道和应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种使红球菌属类微生物在不良环境的胁迫下提高其生长速度和防止菌株退化的方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：在含有红球菌属类微生物的环境中添加相容性物质，所述的相容性物质为嘧啶类或氨基酸类相容性物质，选自四氢嘧啶、羟基四氢嘧啶、甲硫氨酸、组氨酸中的一种或几种；按照菌类的发酵液体积计算，其浓度为10～60mol/l，优选为15-60mol/l。所述的含有红球菌属类微生物的环境中可以含有高渗盐。所述的高渗盐选自：NaCl、NαSO4、KCl中的一种或几种，其浓度为：5％-20％。本专利技术的相容性物质通过如下方法选择：(1)对红球菌属类微生物进行基因组比对，根据比对结果确定红球菌属菌株具有相容性物质的生物合成基因簇；(2)以红球菌(RhodococcusruberSYP-A8695,其16SrRNA序列在NCBI的接收号为MH712435，相容性物质四氢嘧啶合成基因簇序列在NCBI的接收号为MH720339)属菌株为实验对象，进行发酵培养和高盐胁迫性实验，确定菌株适宜的相容性物质需求浓度(10-40mmol/l)；(3)在最适的相容性物质四氢嘧啶浓度下，通过比较高盐浓度下菌株的生长曲线和形态特征，发现相容性物质四氢嘧啶可以提高红球菌属菌株生长速度，并能维持菌体的正常形态、防止红球菌退化。具体地，本专利技术的相容性物质通过如下方法选择：具体步骤如下：(1)对红球菌属类微生物已公开的全基因组序列进行基因水平次级代谢产物的预测，发现已公开的13株红球菌类微生物的全基因组均含有相容性物质四氢嘧啶合成基因簇；(2)对红球菌属菌株在不同盐(NaCl)浓度(0～40％)下培养，检测相容性物质的产生；(3)使用超纯水溶解相容性物质，得到不同浓度(0-40mol/l)的相容性物质溶液，使用0.22μm滤膜对相容性物质溶液过滤除菌；(4)从冻干保藏管中活化红球菌属(Rhodococcus)目标菌株，观察冻干菌体在不同浓度(0-40mmol/l)相容性物质的培养基中的生长速度和生物量，将活化好的目标菌株接入到发酵培养基中，混匀；(5)将步骤(3)中不同浓度(0-40mol/l)的相容性物质溶液加入到步骤(4)中的发酵培养基中，使发酵培养基中相容性物质的浓度为0-40mmol/l进行红球菌属菌株(如，Rhodococcusaerolatus,Rhodococcusaetherivorans,Rhodococcusagglutinans,Rhodococcusaichiensis,Rhodococcusantrifimi,Rhodococcusartemisiae或Rhodococcusaurantiacus，但不限于上述菌株)最适相容性物质浓度筛选；(6)按照步骤(4)中筛选得到的对应菌株最适相容物质的浓度(10-40mmol/l)，进行目标菌株发酵；对在不同发酵条件中生长的菌体进行生长曲线的绘制和形态学观察，确定菌体的生长速度和稳定性。发现相容性物质不仅能提高菌种的生长速度和生物量，还具有防止菌种退化的作用。步骤(1)中，所述的次级代谢产物预测平台为：https://antismash.secondarymetabolites.org/#！/start；所述红球菌属全基因组数据平台为：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/13525？；所述的目标菌株为红球菌属，例如：Rhodococcusruber(RhodococcusruberSYP-A8695,MH712435),Rhodococcusbiphenylivorans(Rhodococcussp.2G,NZ_CP018063.1),Rhodococcusqingshengii(Rhodococcussp.008,NZ_CP012749.1),Rhodococcuscerastii(Rhodococcussp.B7740,NZ_CP010797.1),Rhodococcusqingshengii(Rhodococcussp.BH4,NZ_CP014941.1)等。以RhodococcusruberSYP-A8695为例，在15％高渗盐浓度下培养72h活菌数仅为6.2×106CFU·ml-1，而加入适量相容性溶质后，在15％高渗盐浓度的条件下培养72h后，活菌数可提高近100倍，达5.8×108CFU·ml-1，显著增加该菌株对不良环境的耐受。本专利技术是将红球菌属菌体接种在不同浓度相容性物质的培养基中，从而提高菌体的生长速度、生物量。所述的红球菌属菌体可以为冻干菌体。本专利技术所述的提高红球菌属菌种生长速度和防止红球菌退化的方法，包括如下步骤：(1)使用超纯水溶解相容性物质，得到相容性物质溶液，过滤除菌；(2)将活化好的红球菌属菌株接入到发酵培养基中，混匀，所述的发酵培养基配方为：酵母浸粉4-5‰，葡萄糖4-5‰，麦芽粉2-3‰，复合维生素少许，微量盐1‰，蒸馏水1L；或蛋白胨10-15‰，酵母浸粉4-6‰，NaCl4-6‰，琼脂15-20‰，蒸馏水1L；pH7.0-7.2。(3)将步骤(1)中的相容性物质溶液加入到步骤(2)中的发酵培养基中，观察菌株的生长曲线和形态特征。以红球菌株(RhodococcusruberSYP-A8695,MH712435)及相容性物质四氢嘧啶为例，本专利技术将冻干保存并经长期保藏的菌体接种在含有不同浓度相容性物质的培养基中，可观察到菌体在含有相容性物质的培养基中生长速度和生物量相对于在不含相容性物质的培养基中生长速度加快，生物量增多；经过实验摸索合适的相容性物质浓度，在菌体发酵过程中通过投放合适浓度的相容性物质，发现相容性物质能促进菌体的生长，使菌体的生长速度加快、生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.提高红球菌属菌种生长速度和防止红球菌退化的方法，其特征在于，在含有红球菌属类微生物的环境中添加嘧啶类或氨基酸类相容性物质。

【技术特征摘要】
1.提高红球菌属菌种生长速度和防止红球菌退化的方法，其特征在于，在含有红球菌属类微生物的环境中添加嘧啶类或氨基酸类相容性物质。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)使用超纯水溶解相容性物质，得到相容性物质溶液，过滤除菌；(2)将活化好的红球菌属菌株接入到发酵培养基中，混匀；(3)将步骤(1)中的相容性物质溶液加入到步骤(2)中的发酵培养基中，观察菌株的生长曲线和形态特征。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的相容性物质为四氢嘧啶、羟基四氢嘧啶、甲硫氨酸、组氨酸中的一种或几种。4.如权利要求1-3所述的方法，其特征在于，所述的相容性物质的浓度为10～60mmol·l-1。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的含有红球菌属类微生物的环境中可以含有高渗盐。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的高渗盐选自：NaCl、NaSO4、KCl中的一种或几种，其浓度为：5％-20％。7.如权利要求1-6中任何一项所述的方法，其特征在于，所述的红球菌属菌种为Rhodococcusbiphenylivorans,Rhodococcusqingshengii,Rhodococcuscerastii,Rhodococcusqingshengii...

【专利技术属性】
技术研发人员：张怡轩，章朦玥，侯少阳，
申请(专利权)人：沈阳药科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21