一种获得高DHA含量的裂殖壶藻的方法及沉降罐技术

本发明专利技术涉及一种获得高DHA含量的裂殖壶藻的方法，其包括以下步骤：将裂殖壶藻培养至对数期，得到裂殖壶藻培养物；向所述裂殖壶藻培养物中加入按所述裂殖壶藻培养物体积计0.01‑0.15％的体积分数为30％的过氧化氢，以诱导藻细胞积累油脂，继续培养4‑5天，得到诱导后的裂殖壶藻培养物；移除所述诱导后的裂殖壶藻培养物中的培养液，得到高DHA含量的裂殖壶藻。还涉及一种用于沉降裂殖壶藻的沉降罐。通过本发明专利技术的方法，将整个过程分为培养阶段、诱导阶段和沉降阶段，快速培养3‑4天即可到达一定的生物量，然后通过添加促进剂过氧化氢来诱导藻细胞中的油脂和DHA的积累，由此，既获得了高生物量，又获得了高油脂和DHA含量。

A method for obtaining high DHA content of Chlamydomonas Schizophyllum and its sedimentation tank

The invention relates to a method for obtaining high DHA content of Chlamydomonas schizophyllum, which comprises the following steps: culturing the Chlamydomonas Schizophyllum to logarithmic phase to obtain the culture of Chlamydomonas schizophyllum; adding hydrogen peroxide with a volume of 0.01 0.15% and a volume of 30% according to the culture volume of Chlamydomonas Schizophyllum to induce algae cells to accumulate oil, and continue culturing for 4 5 days to obtain the culture product. After induction, the culture medium of the induced Chlamydomonas spp. is removed and a high DHA content Chlamydomonas spp. is obtained. The invention also relates to a settling tank for settling Chlamydia schizophyllum. By the method of the present invention, the whole process is divided into three stages: culture stage, induction stage and sedimentation stage. A certain biomass can be obtained after 3 to 4 days of rapid culture, and then the accumulation of lipids and DHA in algae cells can be induced by adding hydrogen peroxide as an accelerator. Thus, high biomass, high oil and DHA content can be obtained.

【技术实现步骤摘要】
一种获得高DHA含量的裂殖壶藻的方法及沉降罐
本专利技术涉及微藻培养和不饱和脂肪酸生产领域，更特别地，涉及一种获得高DHA含量的裂殖壶藻的方法及沉降罐。
技术介绍
二十二碳六烯酸(Docosahexaenoicacid，DHA)是目前发现的碳链最长、不饱和度最高的长链高度不饱和脂肪酸。DHA是机体生物膜的重要结构组分，在婴幼儿神经发育、视网膜形成、智力发展等方面具有重要作用，而且也是前列腺素、换前列腺素和白三烯素等具有强烈生理活性的自身调节物质的前体，对预防心血管疾病、抗血脂、降血压、抑制肿瘤形成等具有显著作用。由于具有上述多种重要生理功能，DHA已经成为价值高、市场广泛的脂肪酸产品。裂殖壶藻，其分类地位按照真核生物六界分类法，即真核生物域，囊泡藻界Chromalveolata，异鞭藻类(Heterokontophyta或Stramenopiles)，双环门(Bigyra)，Labyrinthulomycetes目，Thraustochytriaceae科，Schizochytrium属，也称为裂壶藻，单细胞、球形。裂殖壶藻细胞积累大量对人体有用的活性物质，如油脂、色素、角鲨烯等，其中油脂占细胞干重的70％以上，总脂中二十二碳六烯酸(DHA)含量非常高，结构类似的脂肪酸含量低，容易分离纯化，而且没有鱼腥味，故裂殖壶菌是一种极具实现工业化生产DHA潜力的微生物之一。然而，目前裂殖壶藻大规模培养很难获得高DHA含量的藻细胞用于提取DHA。
技术实现思路
为解决以上问题，本专利技术提供了一种获得高DHA含量的裂殖壶藻的方法，包括以下步骤：S1：将裂殖壶藻培养至对数期，得到裂殖壶藻培养物；S2：向所述裂殖壶藻培养物中加入按所述裂殖壶藻培养物体积计0.01-0.15％的体积分数为30％的过氧化氢诱导藻细胞积累油脂，继续培养4-5天，得到诱导后的裂殖壶藻培养物；S3：移除所述诱导后的裂殖壶藻培养物中的培养液，得到高DHA含量的裂殖壶藻。通过本专利技术的方法，将整个过程分为培养阶段、诱导阶段和沉降阶段，快速培养3-4天即可到达一定的生物量，然后通过添加促进剂过氧化氢来诱导藻细胞中的油脂和DHA的积累，由此，既获得了高生物量，又获得了高油脂和DHA含量。在一个实施方案中，S1和S2在发酵罐中进行。在一个优选实施方案中，S1中用于培养所述裂殖壶藻的初始培养基成分为：葡萄糖45.00gL-1，酵母粉10.00gL-1，谷氨酸钠10.00gL-1，氯化钠8.70gL-1，氯化钾0.56gL-1，氯化钙0.70gL-1，硫酸镁·七水4.80gL-1，磷酸二氢钾1.35gL-1，碳酸氢钠0.08gL-1，氯化铁·六水0.01gL-1，金属离子混合液A51.60mLL-1，pH为6.5-7.5。通过使用以上成分的初始培养基，裂殖壶藻能够快速生长分裂，在3-4天内即可达到可观的生物量。在一个优选实施方案中，所述初始培养基中的葡萄糖和磷酸二氢钾与其余组分分开灭菌，灭菌后混合成所述初始培养基。将葡萄糖和磷酸二氢钾与其他成分分开灭菌可防止因美拉德等副反应的发生而降低培养基的培养效果。在一个实施方案中，S1具体包括以下步骤：S11：将生物量浓度为5-15gL-1的裂殖壶藻培养液按1:4-12的体积比接入装有所述初始培养基的发酵罐中；S12：培养所述裂殖壶藻3-4天，即得到所述裂殖壶藻培养物；培养条件为：温度28-30℃，通气量0.2-0.5vvm，搅拌速率120-180rpm，溶氧不低于8％，培养过程中持续补充葡萄糖，使培养物中还原性糖含量不低于15gL-1。通过在培养过程中持续补充葡萄糖的含量，可使裂殖壶藻维持在高速生长的状态。在一个实施方案中，S2中诱导条件为：维持还原性糖含量为15gL-1以上，维持还原性糖的C的摩尔浓度是有机氮中氮的摩尔浓度的的10倍以上，调节pH为5.0-6.0，溶氧为0.5-3％，搅拌速率为60-120rpm；诱导第一天温度控制为23-25℃，第二天及以后控制为16-22℃，诱导时间为3-5天。在S2中通过将C/N比升高，使得藻细胞摄取的有机碳无法转化成蛋白质，而是走脂类合成的通道，温度降低也有助于油脂的积累，结合过氧化氢的作用，使得DHA的含量大大提高。在一个实施方案中，S3包括以下步骤：S31：将S2得到的诱导后的裂殖壶藻培养物装入沉降罐中；S32：向所述诱导后的裂殖壶藻培养物液面上喷洒促沉降剂，所述促沉降剂为乙酸溶液与过氧化氢溶液的混合物；S33：保持所述沉降罐中的温度为16-23℃，静置6-12h，待所述裂殖壶藻沉降；S34：收集沉降浓缩的裂殖壶藻培养物，离心移除剩余的培养液，即得到高DHA含量的裂殖壶藻。促沉降剂中含有乙酸和过氧化氢，乙酸一方面促进裂殖壶藻的沉降，另一方面pH的降低和过氧化氢也有利于DHA的积累，从而在沉降过程中仍然诱导细胞合成DHA。在一个实施方案中，S32中所述促沉降剂由体积分数70％的乙酸水溶液和体积分数为30％的过氧化氢水溶液混合得到，所述70％的乙酸水溶液与所述30％的过氧化氢水溶液的体积比为1:1-4，细胞密度越高，所加的过氧化氢水溶液的量越多；沉降过程中还开启紫外灯照射所述沉降罐中的裂殖壶藻培养物。紫外灯照射也有利于裂殖壶藻细胞积累本专利技术还提供了一种用于沉降裂殖壶藻的沉降罐，其包括罐体、循环冷却系统和光照系统，所述罐体顶部中央设置有人孔，所述人孔上盖有罐盖，所述罐体底部向下隆起，底部中央设置有沉降物出口，所述罐体的侧壁上靠近顶部的位置设置有发酵液入口，所述罐体的侧壁上靠近底部的位置设置有上清液出口；所述罐体顶部内壁上靠近所述人孔设置有所述光照系统；所述罐体内部还设置有支架，用于支撑所述循环冷却系统。在一个优选实施方案中，所述光照系统包括照明灯和紫外灯；所述循环冷却系统包括通过连接管连通的多节冷却管以及冷却液入口和冷却液出口，所述冷却液入口和冷却液出口通过连接管分别与不同的冷却管连通。附图说明图1为本专利技术的沉降罐的示意图。附图中，各标号所代表的部件列表如下：1、罐盖，2、冷却液入口，3、冷却液出口，4、照明灯，5、紫外灯，6、发酵液入口，7、保温套，8、冷却管，9、上清液出口，10、沉降物出口，11、人孔。具体实施方式以下结合实例对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。1.初始培养基的优化基于之前对裂殖壶藻Schizochytriumsp.S31，即ATCC20888，购自美国菌种收藏中心(ATCC)的培养，其培养基中海盐浓度、氮源浓度和碳源浓度对其生长影响较为明显。而裂殖壶藻合成DHA的关键在于前期积累大量的生物量，之后才是进行快速诱导合成油脂DHA。故前期的主要目标是使得裂殖壶藻进行快速增殖。基于前期培养条件的摸索，适于生长的环境条件为25-30℃之间，初始pH可为7.0±1.0，摇瓶回旋往复速率100～150rpm，500mL摇瓶装液量为20-50％，避光或弱光照(≤15μmolm-2s-1)。为探究海盐浓度、氮源、氮源组成比例、葡萄糖浓度，以下培养环境条件设置为28±1℃，初始pH调整为7.0±0.1，摇瓶回旋往复速率为120rpm，500mL摇瓶装液量为100mL，黑暗。1.1海盐浓度的优化基于前期的基础培养基，为探究海盐浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种获得高DHA含量的裂殖壶藻的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：将裂殖壶藻培养至对数期，得到裂殖壶藻培养物；S2：向所述裂殖壶藻培养物中加入按所述裂殖壶藻培养物体积计0.01‑0.15％的体积分数为30％的过氧化氢诱导藻细胞积累油脂，继续培养4‑5天，得到诱导后的裂殖壶藻培养物；S3：移除所述诱导后的裂殖壶藻培养物中的培养液，得到高DHA含量的裂殖壶藻。

【技术特征摘要】
1.一种获得高DHA含量的裂殖壶藻的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：将裂殖壶藻培养至对数期，得到裂殖壶藻培养物；S2：向所述裂殖壶藻培养物中加入按所述裂殖壶藻培养物体积计0.01-0.15％的体积分数为30％的过氧化氢诱导藻细胞积累油脂，继续培养4-5天，得到诱导后的裂殖壶藻培养物；S3：移除所述诱导后的裂殖壶藻培养物中的培养液，得到高DHA含量的裂殖壶藻。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1和S2在发酵罐中进行。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S1中用于培养所述裂殖壶藻的初始培养基成分为：葡萄糖45.00gL-1，酵母粉10.00gL-1，谷氨酸钠10.00gL-1，氯化钠8.70gL-1，氯化钾0.56gL-1，氯化钙0.70gL-1，硫酸镁·七水4.80gL-1，磷酸二氢钾1.35gL-1，碳酸氢钠0.08gL-1，氯化铁·六水0.01gL-1，金属离子混合液A51.60mLL-1，pH为6.5-7.5。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述初始培养基中的葡萄糖和磷酸二氢钾与其余组分分开灭菌，灭菌后混合成所述初始培养基。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S1具体包括以下步骤：S11：将生物量浓度为5-15gL-1的裂殖壶藻培养液按1:4-12的体积比接入装有所述初始培养基的发酵罐中；S12：培养所述裂殖壶藻3-4天，即得到所述裂殖壶藻培养物；培养条件为：温度28-30℃，通气量0.2-0.5vvm，搅拌速率120-180rpm，溶氧不低于8％，培养过程中持续补充葡萄糖，使培养物中还原性糖含量不低于15gL-1。6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S2中诱导条件为：维持还原性糖含量为15gL-1以上，维持还原性糖的C的摩尔浓度是有机氮中氮的摩尔浓度的的10倍以上，调节pH为5.0-6.0，调节pH的物质为体积...

【专利技术属性】
技术研发人员：王强，陈为先，
申请(专利权)人：武汉藻优生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42