提高色绿藻胞内虾青素和藻油积累量的诱导培养方法技术

本发明专利技术涉及一种提高色绿藻胞内虾青素和藻油积累量的诱导培养方法。本发明专利技术采用常规的微藻三角瓶培养和基于微孔板的培养方法，实现色绿藻细胞在不同植物激素和高光无氮条件下的协同诱导培养，最终显著提高色绿藻胞内的虾青素的积累量，同时生产制备藻油。本发明专利技术可以显著改进或取代现有的利用微藻制备天然虾青素的生产方式，可以大大提高虾青素的生产效率，在微藻工业化生产制备虾青素和藻油方面，具有非常重要的应用价值和广阔的市场前景。

Induction Culture Method for Increasing the Accumulation of Astaxanthin and Algae Oil in Chlorophyta chromophora

The invention relates to an induction culture method for increasing the accumulation of astaxanthin and algae oil in the cell of Chlorophyta chromophora. The invention adopts the conventional triangular flask culture of microalgae and the culture method based on microporous plate to realize the co-induction culture of chlorophyll cells under different phytohormones and high light nitrogen-free conditions, and ultimately significantly improves the astaxanthin accumulation in chlorophyll cells, and produces algae oil. The invention can significantly improve or replace the existing production method of natural astaxanthin prepared by microalgae, greatly improve the production efficiency of astaxanthin, and has very important application value and broad market prospects in the industrialized production of astaxanthin and algae oil by microalgae.

【技术实现步骤摘要】
提高色绿藻胞内虾青素和藻油积累量的诱导培养方法
本专利技术属于藻类生物发酵培养工艺
，特别地涉及一种利用植物激素诱导色绿藻同时高效积累虾青素和藻油的方法。
技术介绍
虾青素是一种天然紫红色的酮基类胡萝卜素，化学名为3，3’-二羟基-4，4’-二酮基-β，β’-胡萝卜素，分子式为C40H52O4，分子量为596.86。虾青素(Astaxanthin)被称为“超级抗氧化剂”，抗氧化能力是其它类胡萝卜素如β-胡萝卜素、玉米黄素、叶黄素和角黄素等的10倍多，具有清除自由基、阻止脂质过氧化能力，对于维护眼睛和中枢神经系统健康，增强免疫系统功能、强化肌体能量代谢、抗癌、抗感染等具有多重功效。目前虾青素在食品、医药、保健品和化妆品行业等有着广泛的应用，具有重要的市场价值和广阔的市场前景。目前虾青素的生产方法主要有三种，分别为从虾蟹和鱼类等体内提取生产、化学合成法生产、采用红发夫酵母和红球藻等微藻的生物发酵法生产等，此外还有采用转基因植物技术培养生产虾青素。微藻发酵法生产虾青素是目前虾青素生产的重要生产方式。雨生红球藻培养法是目前天然虾青素的最主要生产制备方法。采用雨生红球藻Haematococcuspluvialis等微藻制备得到的虾青素均为3S，3’S构型，抗氧化活性高，无毒副作用，被FDA(美国食品和药物管理局)和EFSA(欧洲食品安全局)批准作为营养强化剂。但由于雨生红球藻生长速率慢，自养培养周期长，易生物污染等因素的制约，目前虾青素的生产成本较高且生产效率低下。色绿藻(Chromochloris.zofingiensis)是一种单细胞绿藻，生长速率快，能够在黑暗异养条件下利用有机碳源进行异养高密度发酵，实现高密度细胞生长。此外，色绿藻在高光、高盐、氮磷营养元素限制等诱导条件下可以有效积累虾青素，同时还可以积累藻油，是目前虾青素生产的重要潜在微藻种质。相对于自养型雨生红球藻培养生产虾青素而言，色绿藻可以利用现在发酵培养装置在异养条件下实现高密度培养，但是色绿藻胞内虾青素积累量还比较低。筛选高效的诱导胁迫条件，进一步提高色绿藻胞内虾青素含量，进而建立针对色绿藻C.zofingiensis胞内色素尤其是虾青素的诱导培养工艺，这对于色绿藻生产制备虾青素和进一步商业化开发利用具有重要意义。
技术实现思路
为了弥补现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种提高色绿藻胞内虾青素和藻油积累量的诱导培养方法，实现了色绿藻胞内虾青素和藻油的同时高效积累，极大地提高了色绿藻胞内虾青素和藻油的产量。本专利技术的技术目的是通过如下技术方案实现的：本专利技术所述的提高色绿藻胞内虾青素和藻油积累量的诱导培养方法，包括如下步骤：S1、将色绿藻细胞进行活化培养以获得种子液；S2、将步骤S1活化培养获得种子液接种至无氮含糖的培养基，同时加入植物激素类诱导物，在微藻培养装置中进行诱导胁迫培养。进一步地，本专利技术所述植物激素类诱导物为1-氨基环丙烷羧酸(ACC)、2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4D)、2-氯苯甲酸(CA)、赤霉素(GA)、3-吲哚乙酸(IAA)、3-吲哚丁酸(IBA)、3-吲哚丙酸(IPA)、脱落酸(ABA)、激动素(KT)、乙醇胺(ETA)、胺鲜酯(DA)、1-萘乙酸(NAA)中的一种或两种以上。优选地，本专利技术所述植物激素类诱导物选自1-氨基环丙烷羧酸，其添加浓度为1.0～5.0mg/L；或所述植物激素类诱导物选自2，4-二氯苯氧基乙酸，其添加浓度为5.0～10.0mg/L；或所述植物激素类诱导物选自2-氯苯甲酸，其添加浓度为5.0～10.0mg/L；或所述植物激素类诱导物选自赤霉素，其添加浓度为3.5～6.3mg/L；或所述植物激素类诱导物选自3-吲哚乙酸，其添加浓度为7.8～15.7mg/L；或所述植物激素类诱导物选自3-吲哚丁酸，其添加浓度为9.9～49.9mg/L；或所述植物激素类诱导物选自3-吲哚丙酸，其添加浓度为10.0～25.0mg/L；或所述植物激素类诱导物选自脱落酸，其添加浓度为10.0～100.0mg/L；或所述植物激素类诱导物选自激动素，其添加浓度为0.5～5.0mg/L；或所述植物激素类诱导物选自乙醇胺，其添加浓度为76.8～153.7mg/L；或所述植物激素类诱导物选自胺鲜酯，其添加浓度为2.1～21.5mg/L；或所述植物激素类诱导物选自1-萘乙酸，其添加浓度为5.3～10.7mg/L。优选地，本专利技术所述植物激素类诱导物选自1-氨基环丙烷羧酸，其添加浓度为5.0mg/L；或所述植物激素类诱导物选自2，4-二氯苯氧基乙酸，其添加浓度为5.0mg/L；或所述植物激素类诱导物选自2-氯苯甲酸，其添加浓度为5.0mg/L；或所述植物激素类诱导物选自赤霉素，其添加浓度为6.9mg/L；或所述植物激素类诱导物选自3-吲哚乙酸，其添加浓度7.8mg/L；或所述植物激素类诱导物选自3-吲哚丁酸，其添加浓度为9.9mg/L；或所述植物激素类诱导物选自3-吲哚丙酸，其添加浓度为10.0mg/L，或所述植物激素类诱导物选自脱落酸，其添加浓度为10.0mg/L。优选地，本专利技术步骤S2中，加入植物激素类诱导物同时加入助溶剂，所述助溶剂在培养基中浓度为0.01％～0.1％，所述植物激素类诱导物为3-吲哚乙酸、3-吲哚丁酸、赤霉素中一种或两种或三种的组合；优选地，所述助溶剂选自水、乙醇或二甲亚砜。优选地，本专利技术步骤S2中，将所述种子液接种至无氮含糖的培养基，并使种子液中色绿藻细胞密度稀释至2～3g/L，加入植物激素类诱导物，分装至包括透明微孔板或薄层培养装置的微藻培养装置中，并置于振荡器中，然后在光照培养箱中进行诱导胁迫培养，采用光源白光，光源强度为300±30μmolm-2s-1，光暗周期为0h∶24h～24h∶0h，培养温度为20～30℃。优选地，本专利技术步骤S2诱导胁迫的培养温度为20～30℃，光源采用白光，光源强度为300μmolm-2s-1，光暗周期为24h∶0h。优选地，本专利技术步骤S2中所述无氮含糖培养基还包括如下浓度的组分：10g葡萄糖、0.175g磷酸二氢钾、0.075g磷酸氢二钾、0.075g七水硫酸镁、0.025g二水氯化钙、0.025g氯化钠、5mg氯化铁、0.287mg七水硫酸锌、0.169mg一水硫酸锰、0.061mg硼酸、0.0025mg五水硫酸铜、0.00124mg七水钼酸铵。优选地，本专利技术步骤S1中活化培养是将色绿藻细胞转接至液体培养基中进行循环往复振荡培养，培养温度为20～30℃，光源强度为10～300μmolm-2s-1，转速为50～500rpm，光暗周期为0:24(h)～24:0(h)，所述液体培养基pH为6.0～7.0。优选地，本专利技术所述液体培养基选自改良的Bristol、Basal、BG-11、BBM或Kuhl培养基。具体地，本专利技术还包括以下步骤：S3、培养结束后，收集培养的新鲜藻细胞，采用流式细胞仪在通道FL1和通道FL2进行色绿藻细胞的平均荧光强度的快速检测，从而初筛获得色绿藻细胞荧光增强的诱导条件；S4、基于S3所获得诱导条件初筛实验结果，综合分析确定诱导物的种类和浓度，在相同诱导条件下进行色绿藻细胞的重新培养制备，再采用传统的准确检测分析方法测定色绿藻细胞内虾青素及藻油的含量；S5、基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高色绿藻胞内虾青素和藻油积累量的诱导培养方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、将色绿藻细胞进行活化培养以获得种子液；S2、将步骤S1活化培养获得种子液接种至无氮含糖的培养基，同时加入植物激素类诱导物，在微藻培养装置中进行诱导胁迫培养。

【技术特征摘要】
1.一种提高色绿藻胞内虾青素和藻油积累量的诱导培养方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、将色绿藻细胞进行活化培养以获得种子液；S2、将步骤S1活化培养获得种子液接种至无氮含糖的培养基，同时加入植物激素类诱导物，在微藻培养装置中进行诱导胁迫培养。2.根据权利要求1所述的提高色绿藻胞内虾青素和藻油积累量的诱导培养方法，其特征在于：所述植物激素类诱导物为1-氨基环丙烷羧酸、2，4-二氯苯氧基乙酸、2-氯苯甲酸、赤霉素、3-吲哚乙酸、3-吲哚丁酸、3-吲哚丙酸、脱落酸、激动素、乙醇胺、胺鲜酯、1-萘乙酸中的一种或两种以上。3.根据权利要求2所述的提高色绿藻胞内虾青素和藻油积累量的诱导培养方法，其特征在于：所述植物激素类诱导物选自1-氨基环丙烷羧酸，其添加浓度为1.0～5.0mg/L；或所述植物激素类诱导物选自2，4-二氯苯氧基乙酸，其添加浓度为5.0～10.0mg/L；或所述植物激素类诱导物选自2-氯苯甲酸，其添加浓度为5.0～10.0mg/L；或所述植物激素类诱导物选自赤霉素，其添加浓度为3.5～6.3mg/L；或所述植物激素类诱导物选自3-吲哚乙酸，其添加浓度为7.8～15.7mg/L；或所述植物激素类诱导物选自3-吲哚丁酸，其添加浓度为9.9～49.9mg/L；或所述植物激素类诱导物选自3-吲哚丙酸，其添加浓度为10.0～25.0mg/L；或所述植物激素类诱导物选自脱落酸，其添加浓度为10.0～100.0mg/L；或所述植物激素类诱导物选自激动素，其添加浓度为0.5～5.0mg/L；或所述植物激素类诱导物选自乙醇胺，其添加浓度为76.8～153.7mg/L；或所述植物激素类诱导物选自胺鲜酯，其添加浓度为2.1～21.5mg/L；或所述植物激素类诱导物选自1-萘乙酸，其添加浓度为5.3～10.7mg/L。4.根据权利要求3所述的提高色绿藻胞内虾青素和藻油积累量的诱导培养方法，其特征在于：所述植物激素类诱导物选自1-氨基环丙烷羧酸，其添加浓度为5.0mg/L；或所述植物激素类诱导物选自2，4-二氯苯氧基乙酸，其添加浓度为5.0mg/L；或所述植物激素类诱导物选自2-氯苯甲酸，其添加浓度为5.0mg/L；或所述植物激素类诱导物选自赤霉素，其添加浓度为6.9mg/L；或所述植物激素类诱导物选自3-吲哚乙酸，其添加浓度7.8mg/L；或所述植物激素类诱导物选自3-吲哚丁酸，其添加浓度为9.9mg/L；或所述植物激素类诱导物选自3-吲哚丙酸，其添加浓度为10.0mg/L，或所述植物激素类诱导物选自脱落酸，其添加浓度为10.0mg/L。5.根据权利要求1所述的提高色绿藻胞内虾青素和藻油积...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏东，陈俊辉，黄滟波，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44