The present invention provides a method for determining the translation rate of RNA (such as RNA) binding to ribosomes in a fast, economical and targeted manner.
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于测定RNA翻译速率的方法对相关申请的交叉引用本申请要求2016年6月27日提交的美国临时申请号62/355,122的权益。所述申请的全部内容通过引用整体并入本文。权利声明本专利技术是在国立卫生研究院授予的授权号为P50CA168504的政府支持下完成的。政府拥有本专利技术的某些权利。专利技术背景迄今为止，基因表达分析都集中在检测与基因表达相关的核酸的量，这是因为能相对容易地分离、扩增和定量核酸种类。例如，由于已经拥有了用于检测核酸的化学、酶促、扩增、杂交、测序和其他技术，因此通常能够以在成本、劳动力和时间方面有效的方式对给定时间和/或细胞状态下由细胞表达的mRNA分子(即，转录组(transcriptome))进行大规模分析。然而，越来越多的人认识到，确定细胞内核酸如mRNA的翻译状态(即，翻译组(translatome))是用于确定基因表达谱的更准确的测定方法，因为翻译组和基因表达的蛋白产物(即，蛋白质组(proteome))之间的相关性要比转录组和蛋白质组之间的相关性强的多(参见，例如，美国专利号6,013,437和8,486,865；Ingolia(2016)Cell165:22-33；Kingetal.(2016)BriefFunct.Genomics15:22-31；BrarandWeissman(2015)Nat.Rev.Mol.CellBiol.16:651-664；Kitchenetal.(2014)Nat.Neurosci.17:1491-1499；Gawronetal.(2014)Proteomics14:2647-2662；Kuer...
【技术保护点】
1.一种确定RNA‑核糖体复合物群内与核糖体结合的靶RNA丰度的方法，所述方法包括：a)通过以下步骤产生受保护的免于被试剂降解的RNA片段群，所述试剂降解不被核糖体保护的核酸：i)使所述RNA‑核糖体复合物群与试剂接触，所述试剂优选地使所述核糖体在所述RNA分子的一个或多个限定区域处停留足够多的时间，从而使所述核糖体在所述RNA分子的所述一个或多个限定区域处停留，以及ii)使所述RNA‑核糖体复合物群与试剂接触，所述试剂降解不被核糖体保护的核酸；b)使用逆转录酶和至少2条逆转录引物将未降解的RNA转化为互补DNA(cDNA)，其中i)所述至少2条逆转录引物中每一条的3'部分都具有这样的序列：其与所述RNA‑核糖体复合物群内的一个或多个RNA分子的所述一个或多个限定区域基本互补，并在所述逆转录酶的活性温度下或在高于所述活性温度下与所述一个或多个RNA分子的所述一个或多个限定区域发生退火反应，ii)所述至少2条逆转录引物的5'部分具有与步骤c)的反向扩增引物的3'部分基本相同的序列，以及iii)所述至少2条逆转录引物中每一条的长度均为至少约6个核苷酸；c)使用正向和反向扩增引物以及DNA聚...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.06.27 US 62/355,1221.一种确定RNA-核糖体复合物群内与核糖体结合的靶RNA丰度的方法，所述方法包括：a)通过以下步骤产生受保护的免于被试剂降解的RNA片段群，所述试剂降解不被核糖体保护的核酸：i)使所述RNA-核糖体复合物群与试剂接触，所述试剂优选地使所述核糖体在所述RNA分子的一个或多个限定区域处停留足够多的时间，从而使所述核糖体在所述RNA分子的所述一个或多个限定区域处停留，以及ii)使所述RNA-核糖体复合物群与试剂接触，所述试剂降解不被核糖体保护的核酸；b)使用逆转录酶和至少2条逆转录引物将未降解的RNA转化为互补DNA(cDNA)，其中i)所述至少2条逆转录引物中每一条的3'部分都具有这样的序列：其与所述RNA-核糖体复合物群内的一个或多个RNA分子的所述一个或多个限定区域基本互补，并在所述逆转录酶的活性温度下或在高于所述活性温度下与所述一个或多个RNA分子的所述一个或多个限定区域发生退火反应，ii)所述至少2条逆转录引物的5'部分具有与步骤c)的反向扩增引物的3'部分基本相同的序列，以及iii)所述至少2条逆转录引物中每一条的长度均为至少约6个核苷酸；c)使用正向和反向扩增引物以及DNA聚合酶通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所述cDNA，以形成靶RNA的限定区域的可检测数量的扩增的cDNA，其中i)所述正向扩增引物的3'部分具有这样的序列：其与区域基本互补，所述区域与所述相应的逆转录引物的序列相比更符合所述cDNA的3'，并且其在所述DNA聚合酶的活性温度下或在高于所述活性温度下与所述cDNA发生退火反应；ii)所述反向扩增引物的3'部分包含这样的序列：其与相应的逆转录引物的5'部分基本相同，并且在所述DNA聚合酶的活性温度下或在高于所述活性温度下与所述cDNA的互补链或其通过延伸所述正向扩增引物而形成的扩增产物发生退火反应；和iii)所述PCR产物比所述逆转录引物的长度更长；d)用至少一种不同的正向和/或反向扩增引物重复步骤c)，以形成不同靶RNA的限定区域的可检测数目的扩增的cDNA；和e)将步骤c)检测到的扩增的cDNA与步骤d)检测到的扩增的cDNA进行比较，以确定所述RNA-核糖体复合物群内与核糖体结合的靶RNA的丰度。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述RNA-核糖体复合物的所述RNA和/或所述靶RNA是信使RNA(mRNA)、非编码RNA、长非编码RNA(lncRNA)、RNA非翻译区(UTR)、假基因RNA，及其组合。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中通过裂解细胞获得所述RNA-核糖体复合物群，任选地其中用包含一种或多种去污剂的化学物质、机械破碎、超声处理和/或冷冻和解冻裂解所述细胞。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述细胞的形式选自下组：培养的细胞、活组织检查、新鲜细胞、FFPE经福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)细胞、石蜡化细胞和冷冻细胞。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述优选地使所述核糖体在所述RNA分子的一个或多个限定区域处停留的试剂是环己酰亚胺、lactimidomycin、三尖杉酯碱(harringtonine)和/或其衍生物及其组合。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述RNA分子的所述一个或多个限定区域选自下组：翻译起始位点和翻译终止位点。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中足以使所述核糖体在所述RNA分子的所述一个或多个限定区域处停留的时间为至少5秒。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述降解不被核糖体保护的核酸的试剂选自下组：DNA酶(DNase)和RNA酶(RNase)。9.根据权利要求8所述的方法，其中使所述RNA-核糖体复合物在与RNA酶(RNase)接触之前、同时或之后与DNA酶(DNase)接触。10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述不被核糖体保护的核酸是mRNA、非编码RNA、长非编码RNA(lncRNA)、RNA非翻译区(UTR)、假基因RNA，及其组合。11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述不被核糖体保护的核酸是DNA和/或核糖体RNA。12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中使所述RNA-核糖体复合物在与所述降解核酸的试剂接触之前与所述优选地使所述核糖体在所述RNA分子的所述一个或多个限定区域处停留的试剂接触。13.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中使所述RNA-核糖体复合物在与所述降解核酸的试剂接触的同时与所述优选地使所述核糖体在所述RNA分子的所述一个或多个限定区域处停留的试剂接触。14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中在将所述被保护免于降解的RNA片段群转化为cDNA之前对其进行纯化。15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述至少2条逆转录引物中每一条的3'部分均在所述一个或多个限定区域的上游30个核苷酸和下游30个核苷酸的区域内，所述3'部分与所述RNA-核糖体复合物群内的一个或多个RNA分子的所述一个或多个限定区域基本互补。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述基本互补的区域在所述一个或多个限定区域的上游20个核苷酸和下游20个核苷酸的区域内。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述基本互补的区域在所述一个或多个限定区域的上游15个核苷酸和下游15个核苷酸的区域内。18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述至少2条逆转录引物中的每一条的3'部分均具有这样的序列：其与所述RNA-核糖体复合物群内的一个或多个RNA分子的所述一个或多个限定区域基本互补，并且具有这样的序列和/或长度：其在所述逆转录酶的活性温度下或在高于所述活性温度下与所述一个或多个RNA分子的所述一个或多个限定区域发生退火反应，任选地其中所述3'部分是所述至少2条逆转录引物的3’末端。19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述至少2条逆转录引物的5'部分具有这样的序列：其与步骤c)的反向扩增引物的3'部分基本相同，任选地其中所述5'部分是所述至少2条逆转录引物的5'末端。20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述至少2条逆转录引物的5'部分具有与步骤c)的反向扩增引物的3'部分基本相同的序列，并且在所述至少2条逆转录引物中具有共同的序列，用于结合步骤c)所述的反向扩增引物。21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述至少2条逆转录引物的所述RNA结合区域长到足以结合逆转录酶。22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述至少2条逆转录引物特异性结合从所述靶RNA转化而来的cDNA。23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述逆转录酶的活性温度为约40℃至50℃。24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述至少2条逆转录引物中的至少1条的长度为约6至500个核苷酸。25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述至少2条逆转录引物中的至少1条包含经修饰的碱基和/或经修饰的骨架。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述经修饰的骨架包含亚甲基吗啉环和二氨基磷酸酯键。27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述至少2条逆转录引物中的至少1条包含可检测标记。28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中至少2条逆转录引物选自下组：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和40条逆转录引物。29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述延伸温度在逆转录期间向上倾斜。30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述PCR是实时PCR。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述实时PCR是定量实时PCR(qPCR)。32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述正向和反向扩增引物与所述cDNA模板和扩增产物的结合区域长到足以结合所述DNA聚合酶。33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述正向扩增引物特异性结合从所述靶RNA转化而来的cDNA，并且所述反向扩增引物特异性结合从所述靶RNA转化而来的cDNA的互补链。34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述DNA聚合酶的活性温度为至少约50℃。35.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中至少1条所述正向或反向扩增引物包含经修饰的碱基和/或经修饰的骨架。36.根据权利要求35所述的方法，其中所述经修饰的骨架包含亚甲基吗啉环和二氨基磷酸酯键。37.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中至少1条所述正向或反向扩增引物包含可检测标记。38.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中所述可检测标记是一种或多种荧光团，任选地其中所述荧光团是染料或荧光标记的核酸探针，所述染料的荧光强度和/或光谱在与双链DNA结合时发生变化。39.根据权利要求1-38中任一项所述的方法，其中在PCR扩增期间所述退火和延伸循环温度在每个循环内向上倾斜。40.根据权利要求1-39中任一项所述的方法，其中不对所述扩增的cDNA进行测序。41.根据权利要求1-40中任一项所述的方法，其中所述cDNA和/或扩增的cDNA不用于产生cDNA文库。42.根据权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述RNA-核糖体复合物、未降解的RNA、cDNA和/或扩增的cDNA不经梯度或凝胶进行大小选择。43.一种确定RNA-核糖体复合物群内与核糖体结合的靶RNA丰度的方法，所述方法包括：a)通过以下步骤产生受保护的免于被试剂降解的RNA片段群，所述试剂降解不被核糖体保护的核酸：i)使所述RNA-核糖体复合物群与试剂接触，所述试剂优选地使所述核糖体在所述RNA分子的一个或...
【专利技术属性】
技术研发人员：B·B·李，J·赵，
申请(专利权)人：丹娜法伯癌症研究院，
类型：发明
国别省市：美国,US
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。