氘化核糖核苷、N-保护的亚磷酰胺以及寡核苷酸的合成制造技术

本发明专利技术涉及以下的合成：能够展现出生物化学上有用且生物学上有价值的特性、因此具有潜在治疗用途的高纯度氘化糖、氘化亚磷酰胺、氘化核碱基、氘化核苷、氘化寡核苷酸、以及限定序列的氘化RNA。

Synthesis of dephosphoryl ribonucleoside, N- protected phosphamide and oligonucleotide

The present invention relates to the synthesis of high-purity deuterated sugars, deuterated phosphite amides, deuterated nucleotides, deuterated nucleosides, deuterated oligonucleotides, and deuterated RNA with limited sequences that exhibit biochemically useful and biologically valuable properties and therefore have potential therapeutic uses.

【技术实现步骤摘要】
氘化核糖核苷、N-保护的亚磷酰胺以及寡核苷酸的合成本申请为“中国专利申请号：201380042886.X，申请日：2013年7月31日，专利技术创造名称：氘化核糖核苷、N-保护的亚磷酰胺以及寡核苷酸的合成”的分案申请。专利
本专利技术涉及寡核苷酸以及寡核苷酸合成，并且更具体来说，涉及修饰的RNA、亚磷酰胺和RNA寡核苷酸，以及用于合成RNA的方法，所述RNA含有供合成修饰的寡核苷酸用的部分或完全饱和的氘化糖和/或核碱基以及氘化亚磷酰胺。专利技术背景本专利技术涉及以下的合成：能够展现出生物化学上有用且生物学上有价值的特性、因此具有潜在治疗用途的高纯度氘化糖、氘化核碱基、氘化核苷，以及限定序列的氘化RNA。过去数十年中，已经开发出许多RNA和DNA序列，其用于治疗剂、诊断剂、药物设计、细胞内环境中RNA序列的选择性抑制，以及阻断细胞内存在的不同类型的RNA的功能。一种方法是使用反义技术。反义寡核苷酸可用于在哺乳动物细胞中特异性地抑制不当基因表达。反义寡核苷酸可用于杂交并且通过活化RNA酶H而抑制RNA、典型地信使RNA的功能。首先，寡核苷酸通过活化RNA酶H影响靶RNA的水平，所述RNA酶H裂解DNA/RNA杂合体的RNA链。因此，已提议反义寡核苷酸用于治疗疾病。尽管所述技术有潜力成为用于所有疾病的强大工具，但包括分子稳定性在内的数个问题阻碍了所述技术成为主要疾病对抗疗法。另一方法聚焦于使用基于核酸的分子使基因表达在mRNA水平沉默。RNA干扰(RNAi)提供选择性基因抑制的更大潜力，并且提供控制和管理各种生物化学以及药理学过程的更大希望。早期研究说明秀丽隐杆线虫(C.elegans)中的RNA干扰是由21和22个核苷酸的RNA介导，参见Fire等，Nature，391，806-811，1998。这由说明以下的研究进一步证实：通过小的双链RNA特异性抑制基因表达的一般现象是由21和22个核苷酸的RNA介导(GenesDev.，15，188-200，2001)。同时进行的研究证实通过小的双链(dS)RNA对特异性基因表达所致的所述现象在无脊椎动物和脊椎动物中是相似的。各种研究已说明RNAi可用作选择性和特异性基因抑制和调控的强大工具，参见Nishikura,K.，Cell，107，415-418，2001；Nykanen等，Cell，107，309-321，2001；Tuschl,T.,Nat.Biotechnol.,20,446-448,2002；Mittal,V.,NatureRev.,5,355-365,2004；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99,6047-6052,2002；Donze,O.&Picard,D.,Nucl.Acids.Res.,30,e46,2002；Sui,G等，Natl.Acad.Sci.USA，99，5515-5520，2002；Paddison,等，GenesDev.，16，948-959，2002。除了使用天然双链(ds)RNA序列，化学修饰的RNA已示出在用于siRNA活性的序列中使用2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿糖核酸(FANA)而在哺乳动物细胞中引起类似的或增高的RNA干扰，参见Dowler等，Nucl.AcidsRes.，34，1669-1675，2006。已寻求改进SiRNA特性的各种其他修饰，包括改变骨架化学、2’-糖修饰、核碱基修饰，参见Nawrot,B等，Med.Chem.，6,913-925，2006以及Manoharan，M.Curr.Opin.Chem.Biol.，8，570-579，2004的综述。尽管已容许SiRNA的修饰，但数个研究指示毒性增大且功效降低，参见Harborth,等，AntisenseNucleicAcidDrugDev.，13，83-105，2003。Chiu等证明尽管2’-O-甲基修饰维持A形式的RNA样螺旋，但确实保留了SiRNA活性，或在一些情况下，降低了SiRNA活性，这取决于序列内所述修饰的数量，参见RNA，9，1034-1048，2003。还已示出可在有义链中对序列进行广泛2’-O甲基修饰，而不损失SiRNA活性，参见Kraynack,B.A.,Baker,B.F.，RNA，12，163-176，2006。已将赋予高结合亲和力的双环锁定核酸(LNA)引入SiRNA序列，尤其是在避免SiRNA序列的中心区的情况下，参见Braash等，Biochemistry，42，7967-7995，2003。类似地，已示出含有刚性构象的阿卓糖醇糖修饰的寡核苷酸(ANA)以一种序列特异性方式与RNA形成可降解的双链体。另外，ANA已示出保留A(RNA类型)构象。Fisher,M.等，Nucl.AcidsRes.，35，1064-1074，2007证明与未修饰的对照相比，靶向MDR1基因的ANA修饰的siRNA展现出改善的功效、在修饰接近有义或反义链的3’端时尤其有效。数个研究已指示siRNA通过各种递送系统吸收的潜力。所述递送系统然后可在治疗剂的开发中利用。胆固醇缀合的siRNA可实现递送到细胞中并且使基因表达沉默。另外，脂质缀合的siRNA、胆汁酸以及长链脂肪酸可介导siRNA吸收到细胞中并且体内使基因表达沉默。siRNA缀合物在组织中的有效且选择性吸收取决于与脂蛋白颗粒的最大缔合性、脂蛋白/受体相互作用以及跨膜蛋白介导的吸收。高密度脂蛋白将siRNA的递送导向到肝脏、肠管、肾脏以及含有甾类的器官中。此外，LDL将siRNA主要导向到肝脏中。研究指示LDL受体涉及在siRNA的递送中。因此，已提议siRNA可经设计具有化学修饰以便保护免于核酸酶降解、消除炎症、降低脱靶基因沉默，并且从而提高对靶基因的有效性。脂质和允许增高的细胞吸收的其他亲脂性分子的递送媒介物或缀合物对于治疗开发是必需的。所述siRNA目前正开发用于人类靶标验证，并干扰疾病途径且开发新的领域用于药物开发。siRNA的有义链的3’端可被修饰，并且在此端附接配体是最合适的，参见例如Ya-LinChiu和TariqRana，RNA，9，1034-1048，2003；M.Manoharan，Curr.Opin.Chem.Biol，6，570-579，2004；Nawrot,B.和Sipa,K.，Curr.Top.Med.Chem.，6，913-925，2006；Scaringe,S.等，Biotechnol.，22，326-30，2004。亲脂性或疏水性基团的引入和siRNA递送的增高以及靶标的最优化已通过生物缀合解决并实现。通常，附接在有义链的3’端进行，但可在反义链的3’端进行。核酸酶抗性siRNA的设计曾为尝试开发有效治疗剂的深入研究和开发的主题。因此，碱基修饰如2-硫代尿苷、假尿苷以及二氢尿苷已说明了对RNA分子的构象和相关联的生物活性的作用，参见Sipa等，RNA，13，1301-1316，2007。Layzer等，RNA，10，766-771，2004说明2’-修饰的RNA、尤其是2’-氟对核酸酶具有极大的抗性并且体内具有生物活性。Dande等，Med.Chem.，49，1624-1634，2006使用4’-硫代修饰的糖核苷组合2’-O本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于合成修饰的核糖寡核苷酸的方法，该核糖寡核苷酸具有包括以下的结构式：

【技术特征摘要】
2012.07.31 US 13/563,3431.一种用于合成修饰的核糖寡核苷酸的方法，该核糖寡核苷酸具有包括以下的结构式：其中：D为氘；B为核碱基；n表示所述寡核苷酸中核苷的数量，且大于1；W为氧或硫；Y为氧、C1-C18烷氧基、C1-18烷基；NHR3，其中R3为C1-C18烷基或C1-C4烷氧基-C1-C6-烷基；NR3R4，其中R3如以上所定义并且R4为C1-C18烷基，或其中R3如以上所定义并且R4为C1-C18-烷基，或其中R3和R4与携带它们的氮原子一起形成5-6元杂环，所述杂环可以另外含有另一来自系列O、S以及N的杂原子。2.根据权利要求1所述的用于合成修饰的核糖寡核苷酸的方法，其中W为氧，Y为氧。3.根据权利要求1所述的用于合成修饰的核糖寡核苷酸的方法，其中W为硫，Y为氧。4.根据权利要求1所述的用于合成修饰的核糖寡核苷酸的方法，其中所述B为天然存在的核碱基、修饰的核碱基或其组合。5.根据权利要求4所述的用于合成修饰的核糖寡核苷酸的方法，其中所述B为部分或完全氘化的。6.根据权利要求4所述的用于合成修饰的核糖寡核苷酸的方法，其中所述核苷酸具有变异的核苷酸间键。7.根据权利要求1所述的用于合成修饰的核糖寡核苷酸的方法，其具有完全氘化的核糖与部分氘化的核糖的混合物。8.根据权利要求1所述的用于合成修饰的核糖寡核苷酸的方法，其中所述核糖单元包括至少一种天然的核糖单元和至少一种氘化的核糖单元。9.根据权利要求1所述的用于合成修饰的核糖寡核苷酸的方法，其中所述Y代表公式O-C(Y1Y2)-C(Y3Y4)-X，其中O为氧；Y1、Y2、Y3、Y4为单个或多个为氢、甲基、乙基；X为吸电子基。10.一种用于合成修饰的核糖寡核苷酸的方法，该核糖寡核苷酸具有包括以下的结构式：其中：D为氘；B为核碱基；n表示所述寡核苷酸中核苷的数量，且大于1；W为氧或硫；Y为氧、C1-C18烷氧基、C1-18烷基；NHR3，其中R3为C1-C18烷基或C1-C4烷氧基-C1-C6-烷基；NR3R4，其中R3如以上所定义并且R4为C1-C18烷基，或其中R3如以上所定义并且R4为C1-C18-烷基，或其中R3和R4与携带它们的氮原子一起形成5-6元杂环，所述杂环可以另外含有另一来自系列O、S以及N的杂原子，该方法包括以下步骤：将氘引入到核糖结构的多个位置上以形成氘化核糖，所述氘化核糖在2位上具有至少一个氘，在3位上具有至少一个氘，并且在5位上具有至少两个氘；将含氮碱基结构引入到所述氘化核糖结构中，由此在核糖结构的多个位置上形成引入氘以形成第二氘化核糖结构，所述第二氘化核糖结构在2位上具有至少一个氘，在3位上具有至少一个氘，并且在5位上具有至少两个氘；将含氮碱基结构引入到所述第二氘化核糖结构中，由此形成第二氘化核苷酸；将所述第一氘化的核苷与所述第二氘化的核苷酸化学连接。11.根据权利要求10所述的用于合成修饰的核糖寡核苷酸的方法，其中所述核糖寡核苷酸包括天然的核碱基、修饰的核碱基或其组合。12.根据权利要求11所述的用于合成修饰的核糖寡核苷酸的方法，其中所述天然的核碱基为腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶或其组合。13.根据权利要求10所述的用于合成修饰的核糖寡核苷酸的方法，其中所述RNA核苷酸具有天然存在的核苷酸和氘化核苷酸的混合物。14.根据权利要求10所述的用于合成修饰的核糖寡核苷酸的方法，其中用未修饰的寡核苷酸稀释所述RNA，从而形成氘化小于100％的修饰的寡核苷酸溶液，所述修饰的寡核苷酸具有所需序列。15.根据权利要求10所述的修饰的核糖寡核苷酸，其中所述X可以为CN、NO2、SO2。16.根据权利要求10所述的用于合成修饰的核糖寡核苷酸的方法，该方法还包括以下步骤：合成一个或多个另外的修饰的核糖核苷，所述核糖核苷在2位上包含至少一个氘，在3位上包含至少一个氘，并且在5位上包含至少两个氘；将所述第二核苷与所述一个或多个另外的氘化核苷化学连接。17.一种合成包含氘的修饰的核糖寡核苷酸的方法，该方法包括以下步骤：提供第一修饰的核糖核苷，所述核糖核苷在2位上具有至少一个氘，在3位上具有至少一个氘，并且在5位上具有至少两个氘；提供至少一个第二修饰的核糖核苷，所述核糖核苷在2位上具有至少一个氘，在3位上具有至少一个氘，并且在5位上具有至少两个氘；以及将所述第一修饰的核糖核苷与所述至少一个包含氘的第二修饰核糖核苷连接，以形成具有以下通式的修饰的核糖寡核...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·C·斯里瓦斯塔瓦，A·保尾，
申请(专利权)人：阿萨德有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US