一种从脐带中获得间充质干细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种从脐带中获得间充质干细胞的方法。包括，脐带洗涤后用安尔碘和/或75％酒精消毒：再去除血管、分离华通氏胶；铺板培养；换液培养并第14d或细胞汇合度达到45‑55％收获：消化过滤。本发明专利技术所述方法可更加快速的获得原代间充质干细胞(

A method of obtaining mesenchymal stem cells from umbilical cord

The invention discloses a method for obtaining mesenchymal stem cells from umbilical cord. Including: disinfection of umbilical cord with Aneriodine and/or 75% alcohol after washing: removing blood vessels, separating Walton's gum; plate culture; fluid exchange culture and 14 days or cell confluence reaching 45 55% harvest: digestion and filtration. The method of the invention can obtain primary mesenchymal stem cells more quickly.\uff08

【技术实现步骤摘要】
一种从脐带中获得间充质干细胞的方法
本专利技术涉及细胞制备领域，尤其涉及一种从脐带中获得间充质干细胞的方法。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymalstemcell，MSC)是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类多能干细胞。MSC具有免疫调节、促进造血恢复、能够修复损伤或病变的组织器官、具备多向分化潜能等功能,因此具有广泛的应用前景。但是目前从脐带中制备间充质干细胞的方法耗时长，获得的间充质干细胞数量少，同时操作过程中容易污染。比如CN105586309A公开的是从脐带中制备间充质干细胞的方法，将添加抗生素的清洗液清洗后的脐带剪成约2cm长度的小段，经过处理后再充分剪碎成1-3mm3～3mm3大小，平分到已加完全培养基的175cm2培养瓶中，轻轻摇晃使其均匀分布于瓶底；培养箱中培养，第八天更换培养基，将得到的细胞液离心，重悬，铺瓶后培养箱中培养。此方法使得后续的培养经常不得不通过添加抗生素来防止污染，增加了临床应用的安全隐患。同时操作时间长。组织块过大，能铺的培养瓶数目少，细胞数目也相应较少。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种从脐带中获得间充质干细胞的方法。所述方法可更加快速的获得原代间充质干细胞(<15day)，操作更加简便，相同量组织块下获得的原代间充质干细胞数量更多，且能够有效的避免污染，无需在后续的培养中加入抗生素来防止细胞污染。为实现上述目的，本专利技术提供一种从脐带中获得间充质干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤，脐带的洗涤与消毒：将健康的脐带进行洗涤后再使其浸没到安尔碘或75％酒精中进行消毒，消毒时间不得超过30s，加入清洗液清洗1-2遍；或者，将健康的脐带进行洗涤后再使其浸没到安尔碘或75％酒精中进行消毒，消毒时间不得超过30s，加入清洗液清洗1-2遍后，再使其浸没到75％酒精或安尔碘中进行消毒，每次消毒时间不得超过30s；再加入清洗液清洗1-2遍；去除血管、分离华通氏胶：去掉脐带的头尾后，将剩余的脐带剪成1-3cm段；优选的，将剩余的脐带剪成1.5-2.5cm段；更优选的，将剩余的脐带剪成2cm段；用齿镊剥开外表皮，剔除静脉和动脉血管，剥离其中的华通氏胶，将华通氏胶用清洗液清洗；铺板培养：华通氏胶中加入无血清培养基，使其刚好浸没华通氏胶，用剪刀将华通氏胶剪碎至0.1-1mm3；添加无血清培养基使剪碎的组织块重悬，再转移组织块到培养瓶中，并补加无血清培养基；使组织块平均分布在培养瓶上，并使培养基润湿整个瓶底，做好标记，放入培养箱内培养，6-8d内，优选的，7d内不得移动；培养箱培养；优选的，培养条件为37度5％CO2饱和湿度培养；换液培养并收获：7d后在每个培养瓶内补加培养基，第10d换液，吸去原培养基，每瓶加入新鲜培养基25mL，继续培养；第14d时或细胞汇合度达到45-55％；优选的，达到50％即可收获；消化过滤：弃去原培养基，加入生理盐水清洗后加入含EDTA的胰酶孵育，待细胞变圆脱落时再加入胰酶终止液进行细胞收集，收集的细胞进行离心，弃去上清，用生理盐水重悬细胞后过70um细胞筛过滤除去组织块，再次离心去掉上清。进一步，所述健康的脐带的产妇为无家族史和遗传史的足月待产剖腹产的产妇，产妇将胎儿娩出后胎儿健康无畸形或先天性疾病。进一步，所述脐带在胎儿娩出后，常规断脐，选取中部10-20cm的脐带，用酒精纱布清洁消毒后剪断。进一步，所述脐带的洗涤与消毒步骤中，脐带加入清洗液，盖上盖子后上下颠倒清洗，如此反复2-4次后，再转移脐带，加入安尔碘消毒液，使其浸没整个脐带，盖上盖子立即上下颠倒2-4次后转移脐带，再加入清洗液清洗，整个过程不得超过30s；清洗完毕后再转移脐带，加入75％酒精浸没脐带，盖上盖子立即上下颠倒2-4次后转移脐带，整个过程不得超过30s，加入清洗液清洗1-3遍。进一步，所述去除血管、分离华通氏胶步骤中，去掉脐带的头尾各0.5-1.5cm后；优选的，去掉脐带的头尾各1cm后，将剩余的脐带剪成1-3cm段；更优选的，将剩余的脐带剪成1.5-2.5cm段；更优选的，将剩余的脐带剪成2cm段；用齿镊剥开外表皮，剔除静脉和动脉血管，剥离其中的华通氏胶，将华通氏胶用清洗液清洗1-3遍；优选的，清洗3遍。进一步，所述换液培养并收获步骤中：7d后在每个培养瓶内补加培养基；优选的，按照培养瓶底面积每10cm2补加培养基0.5-0.8mL，更优选的，按照培养瓶底面积每10cm2补加培养基0.6mL；第10d换液，吸去原培养基，每瓶加入新鲜培养基；优选的，按照培养瓶底面积每10cm2补加培养基0.1-0.5mL，更优选的，按照培养瓶底面积每10cm2补加培养基0.3mL继续培养；第14d时或细胞汇合度达到45-55％；优选的，达到50％即可收获：进一步，所述消化过滤步骤中，弃去原培养基，加入生理盐水清洗1-2遍后加入含EDTA的胰酶；优选的，每10cm2添加0.1-0.5mL；更优选的，每10cm2添加0.3mL；室温孵育3-6min，待细胞变圆脱落时再加入胰酶终止液；优选的，每10cm2添加0.5-0.8mL；更优选的，每10cm2添加0.6mL；进行细胞收集，收集的细胞进行离心300g，5min，弃去上清，用生理盐水重悬细胞后过70um细胞筛过滤除去组织块，再次300g，5min离心去掉上清所述脐带在胎儿娩出后，常规断脐，选取中部10-20cm的脐带，用酒精纱布清洁消毒后剪断。此部分脐带不易受污染，状态稳定。本专利技术还可以使用其他规格的容器容纳脐带组织来达到封闭清洗的目的。比如5mL离心管，200mL离心管，250mL储液瓶等。本专利技术与现有技术的区别：现有方案均仅注重对产妇的传染病进行筛查，而对其他方面关注不多。本专利技术对产妇除了筛查传染病外，更注重于筛查遗传病史和家族病史，胎儿的健康状况亦是筛查重点，这极大的增加了样品的安全性，为今后的临床应用减少隐患。现有方案中脐带的清洗均在培养皿中进行，开放的空间极易造成污染，且不容易清洗干净，本专利技术的清洗均在封闭空间内，极大的减少了污染，在整个实验室处理的过程中，仅分离和剪碎华通氏胶的时候是开放操作的，这能极大的减少污染的可能。现有方案仅在采集脐带的时候使用医用酒精擦拭来达到消毒的目的，其余仅依靠采集环境本身来保证脐带的无菌，且通过添加抗生素的清洗液来达到去除脐带本身污染的目的，这极易造成后续的细胞培养中由于样品本身引起的污染，使得后续的培养经常不得不通过添加抗生素来防止污染，增加了临床应用的安全隐患。本专利技术的脐带通过安尔碘消毒和75％酒精消毒，安尔碘和75％酒精对细胞损伤比较大，且会导致组织块失水，故而容易导致脐带组织表面的细胞死亡，造成培养失败，特别是贴壁的组织块较大或未剔除脐带表皮时，由于脐带表面接触到消毒液的部分细胞基本死亡，故而不容易爬出细胞。且现有技术为防止污染，大多在后续的培养中添加青链霉素等抗生素，无需如此消毒也能防止污染。而本方案一方面剔除了脐带表皮的死细胞，另一方面组织块剪的更碎，内部完好的细胞能够暴露出来进行贴壁，且增大了组织块与培养瓶的贴壁面积，故而能够既消除潜在的污染又不会导致培养失败。2次的消毒过程，极大的避免了由于样品本身带来的污染，为后续的细胞培养清除了污染隐患，使得后续的细胞培养过程中无需再添加本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从脐带中获得间充质干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤，脐带的洗涤与消毒：将健康的脐带进行洗涤后再使其浸没到安尔碘或75％酒精中进行消毒，消毒时间不得超过30s，加入清洗液清洗1‑2遍；或者，将健康的脐带进行洗涤后再使其浸没到安尔碘或75％酒精中进行消毒，消毒时间不得超过30s，加入清洗液清洗1‑2遍后，再使其浸没到75％酒精或安尔碘中进行消毒，每次消毒时间不得超过30s；再加入清洗液清洗1‑2遍；去除血管、分离华通氏胶：去掉脐带的头尾后，将剩余的脐带剪成1‑3cm段；优选的，将剩余的脐带剪成1.5‑2.5cm段；更优选的，将剩余的脐带剪成2cm段；用齿镊剥开外表皮，剔除静脉和动脉血管，剥离其中的华通氏胶，将华通氏胶用清洗液清洗；铺板培养：华通氏胶中加入无血清培养基，使其刚好浸没华通氏胶，用剪刀将华通氏胶剪碎至0.1‑1mm3；添加无血清培养基使剪碎的组织块重悬，再转移组织块到培养瓶中，并补加无血清培养基；使组织块平均分布在培养瓶上，并使培养基润湿整个瓶底，做好标记，放入培养箱内培养，6‑8d内，优选的，7d内不得移动；培养箱培养；优选的，培养条件为37度5％CO2饱和湿度培养；换液培养并收获：7d后在每个培养瓶内补加培养基，第10d换液，吸去原培养基，每瓶加入新鲜培养基25mL，继续培养；第14d时或细胞汇合度达到45‑55％；优选的，达到50％即可收获；消化过滤：弃去原培养基，加入生理盐水清洗后加入含EDTA的胰酶孵育，待细胞变圆脱落时再加入胰酶终止液进行细胞收集，收集的细胞进行离心，弃去上清，用生理盐水重悬细胞后过70um细胞筛过滤除去组织块，再次离心去掉上清。...

【技术特征摘要】
1.一种从脐带中获得间充质干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤，脐带的洗涤与消毒：将健康的脐带进行洗涤后再使其浸没到安尔碘或75％酒精中进行消毒，消毒时间不得超过30s，加入清洗液清洗1-2遍；或者，将健康的脐带进行洗涤后再使其浸没到安尔碘或75％酒精中进行消毒，消毒时间不得超过30s，加入清洗液清洗1-2遍后，再使其浸没到75％酒精或安尔碘中进行消毒，每次消毒时间不得超过30s；再加入清洗液清洗1-2遍；去除血管、分离华通氏胶：去掉脐带的头尾后，将剩余的脐带剪成1-3cm段；优选的，将剩余的脐带剪成1.5-2.5cm段；更优选的，将剩余的脐带剪成2cm段；用齿镊剥开外表皮，剔除静脉和动脉血管，剥离其中的华通氏胶，将华通氏胶用清洗液清洗；铺板培养：华通氏胶中加入无血清培养基，使其刚好浸没华通氏胶，用剪刀将华通氏胶剪碎至0.1-1mm3；添加无血清培养基使剪碎的组织块重悬，再转移组织块到培养瓶中，并补加无血清培养基；使组织块平均分布在培养瓶上，并使培养基润湿整个瓶底，做好标记，放入培养箱内培养，6-8d内，优选的，7d内不得移动；培养箱培养；优选的，培养条件为37度5％CO2饱和湿度培养；换液培养并收获：7d后在每个培养瓶内补加培养基，第10d换液，吸去原培养基，每瓶加入新鲜培养基25mL，继续培养；第14d时或细胞汇合度达到45-55％；优选的，达到50％即可收获；消化过滤：弃去原培养基，加入生理盐水清洗后加入含EDTA的胰酶孵育，待细胞变圆脱落时再加入胰酶终止液进行细胞收集，收集的细胞进行离心，弃去上清，用生理盐水重悬细胞后过70um细胞筛过滤除去组织块，再次离心去掉上清。2.如权利要求1所述从脐带中获得间充质干细胞的方法，其特征在于，所述健康的脐带的产妇为无家族史和遗传史的足月待产剖腹产的产妇，产妇将胎儿娩出后胎儿健康无畸形或先天性疾病。3.如权利要求1所述从脐带中获得间充质干细胞的方法，其特征在于，所述脐带在胎儿娩出后，常规断脐，选取中部10-20cm的脐带，用酒精纱布清洁消毒后剪断。4.如权利要求1所述从脐带中获得间充质干细胞的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：林雨国，周亚楠，
申请(专利权)人：厦门博瑞思生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35