植物作为宿主在表达表皮生长因子中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及植物尤其是植物作为宿主在表达表皮生长因子中的应用。本发明专利技术利用重组载体以及农杆菌介导真空渗透方法来表达人表皮细胞生长因子(human epidermal growth factor，简称EGF)。该表达体系确定植物外源蛋白在农杆菌侵染4d后就可以收集。利用SDS‑PAGE法、免疫印迹法(Western法)确定重组EGF成功表达。细胞增值实验证明植物尤其是生菜生产的EGF具有生物学活性。本发明专利技术提供了一种低成本、方便、大量生产具有活性重组人EGF的方法。

Application of Plant as Host in Expressing Epidermal Growth Factor

The invention relates to the field of biotechnology, in particular to the application of plants, especially plants as hosts, in expressing epidermal growth factor. The recombinant vector and the vacuum osmosis method mediated by Agrobacterium tumefaciens are used to express human epidermal growth factor (EGF). The expression system confirmed that plant exogenous proteins could be collected after 4 days of infection by Agrobacterium tumefaciens. The successful expression of recombinant EGF was determined by SDS PAGE and Western blotting. Cell proliferation experiments showed that EGF produced by plants, especially lettuce, had biological activity. The invention provides a low cost, convenient and mass production method of recombinant human EGF with activity.

【技术实现步骤摘要】
植物作为宿主在表达表皮生长因子中的应用
本专利技术涉及生物
，特别涉及植物作为宿主在表达表皮生长因子中的应用。
技术介绍
生长因子是一种天然存在的物质，可以刺激细胞生长,扩散、疗愈以及细胞分化。生长因子通常是一个蛋白质或者一个甾类激素。生长因子对调节多种细胞过程具有非常重要的作用。生长因子通常作为细胞间信号分子，促进细胞分化和成熟。但是每个生长因子之间的的作用不同。例如,骨形成蛋白刺激骨细胞分化，成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子刺激血管分化(血管生成)。表皮生长因子(EGF)通过绑定到其受体,表皮生长因子受体来刺激细胞生长和分化。人类表皮生长因子是一个6kDa蛋白质，有53氨基酸残基和三个分子内二硫键。重组人类表皮生长因子,出售品牌为Heberprot-P下,用于治疗糖尿病足溃疡。它可以通过伤口注射,或者外部涂抹使用，证据其可改善伤口愈合。目前，EGF生长因子在大肠杆菌中生产。植物作为药物蛋白质的表达和生产系统，已经研究了近三十年。除了低成本和产量高等的优点外，基于植物的表达系统还降低了人和动物病原体从产生蛋白质的过程中传播到人类的风险。此外，植物真核蛋白内膜表达系统和分泌途径类似于哺乳动物细胞。植物表达系统可大量生产大分子量以及多亚基的药物蛋白质，且大大优于原核生物表达系统，比如大肠杆菌表达系统。如需要翻译后修饰的，糖基化的蛋白，以及需要组装的单克隆抗体，其不能用原核系统实现。利用植物生产的药用蛋白作为生物试剂已经商业化，或用作家禽的疫苗添加剂。2012年，美国食品和药物管理局(FDA)批准了用于治疗遗传疾病1型戈谢病的蛋白ELELYSOTM(taliglucerasealfa)，而这种蛋白是利用胡萝卜生产的。在过去十年中，人们对药物蛋白质的需求急剧增加，所以FDA批准用于临床试验的植物药用蛋白质的数量也在不断增加。植物瞬时表达系统可以大量生产重组蛋白用于临床研究或者应对突发性疾病。2014年，唯一用于有效抵抗埃博拉病毒爆发的抗体治疗药物，ZMappTM，就是农杆菌渗透方法在烟草叶片中生产。ZMapp的功效和安全性为推动植物制药业的行业开辟了道路。目前，烟草瞬间蛋白表达最常见的宿主植物，并且已经开发了各种载体和农杆菌渗透方法，用于在短时间内进行大规模生产。然而，烟草具有高纤维含量和潜在的有毒化合物，如生物碱尼古丁，显著增加了下游纯化过程中的成本，极大地阻碍了植物外源蛋白药物的进一步发展。与烟叶系统相比，生菜中含有更少的酚类和有毒化合物，因此，将植物尤其是生菜作为宿主在表达表皮生长因子具有重要的现实意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供植物尤其是生菜作为宿主在表达表皮生长因子中的应用。本专利技术利用生菜作为重组蛋白生产的有效平台，消除了植物生长周期，大大节省了前期培育植物的时间。本专利技术用生菜系统表达了EGF，并且在温和的条件下成功分离出有活性的外源蛋白，证明生菜表达平台可以用来生产EGF生长因子。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了植物作为宿主在表达表皮生长因子中的应用；所述植物选自生菜、白菜、玉米、大豆或小麦；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述表皮生长因子为人表皮生长因子。本专利技术还提供了一种表达载体，包括表皮生长因子的核苷酸序列和双元植物载体。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述表达载体中所述表皮生长因子为人表皮生长因子。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述表达载体的构建方法包括如下步骤：步骤1：在表皮生长因子的核苷酸序列的5’末端加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端加入Sacl限制性酶切位点；步骤2：克隆获得pUC57-EGF克隆载体；步骤3：通过Xbal/Sacl从步骤2所得的克隆载体中获得基因片段EGF，，克隆至双元植物载体pCam35S，获得表达载体p35S-EGF。具体的，本专利技术提供的表达载体的构建方法为：将人EGF(GenBankAccession号：A00372.1)由金斯瑞(南京)设计并合成。在EGF序列5’末端加入Xbal，在3’末端加入Sacl位点，并由金斯瑞(南京)克隆到pUC57-EGF载体中(图1A)。生长因子基因片段EGF通过Xbal/Sacl从pUC57-EGF克隆载体中分离(图1B)，并克隆到双元植物载体pCam35S，分别产生瞬时表达载体p35S-EGF(图2)。在完成构建体后，用特异性限制酶消化证实基因片段是完整的。植物表达载体通过Xbal/Sacl分离出EGF基因片段。将上述植物表达构建体通过用Multiporator(Eppendorf，Hamburg，Germany)电穿孔转化到根癌土壤杆菌GV3101中。将所得菌株均匀地铺展在含有卡那霉素抗生素(50mg/L)的选择性LB平板上。在黑暗中28℃孵育2d后，挑取单菌落接种到0.5LYEB(酵母提取物肉汤，5g/L蔗糖，5g/L胰蛋白胨，6g/L酵母提取物，0.24g/LMgSO4，pH7.2)并补充抗生素液体培养基(50mg/L卡那霉素)。将接种的培养物在振荡器(220rpm)中以25～28℃孵育72h。通过添加YEB培养基测量OD600值并调节至3.5～4.5。然后收集培养液，离心(4500转速)10min。将农杆菌细胞重悬在渗透培养基(10mMMES，10mMMgSO4)中至O.D.600为0.5。在本专利技术中，EGFcDNA序列(GenBankAccession号：A00372.1)如SEQIDNo.1所示；EGF氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。本专利技术还提供了所述表达载体在表达表皮生长因子中的应用。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述表皮生长因子为人表皮生长因子。本专利技术还提供了一种植物作为宿主表达生长因子的方法，将所述的表达载体转化到农杆菌中，通过农杆菌介导真空渗透入植物组织后，提取、分离蛋白质，获得表皮生长因子；所述植物选自生菜、白菜、玉米、大豆或小麦；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述表皮生长因子为人表皮生长因子。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述农杆菌介导真空渗透包括如下步骤：步骤1：抽真空25～45s；步骤2：保持真空(-95kPa)压力30～60s；步骤3：释放压力使得渗透液渗入所述植物组织；重复上述步骤2～3次，避光处理4d。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述农杆菌为根癌土壤杆菌GV3101。具体的，农杆菌介导真空渗透的方法为：将制备好的农杆菌培养悬浮液置于2L烧杯，并置于干燥器中。将本实验室保存的生菜倒置(核心向上)并轻轻地旋转于细菌悬浮液中，将干燥器密封。将真空泵(WelchVacuum，Niles，IL，USA)打开以抽空，并且可见渗透液在叶片组织中。保持压力状态30～60s。快速打开该系统以释放压力，使渗透液渗入组织内的空间。该过程重复2～3次，直到清晰可见渗透液在生菜组织中扩散明显。然后将生菜组织从渗透液中轻轻取出，并用蒸馏水连续冲洗三次，然后转移到塑料膜覆盖的容器中。将处理的样品在黑暗中保持4d。渗透后，绝大多数生菜组织在真空浸润过程中淹没，除了坚固的中肋区域外，其余部分均在真空渗透4天后显示淡黄褐色区域。为了增加浸入叶组织的土壤农杆菌的数量，使用剪刀将10本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.植物作为宿主在表达表皮生长因子中的应用；所述植物选自生菜、白菜、玉米、大豆或小麦；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。

【技术特征摘要】
1.植物作为宿主在表达表皮生长因子中的应用；所述植物选自生菜、白菜、玉米、大豆或小麦；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述表皮生长因子为人表皮生长因子。3.一种表达载体，其特征在于，包括表皮生长因子的核苷酸序列和双元植物载体。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表皮生长因子为人表皮生长因子。5.根据权利要求3或4所述的表达载体，其特征在于，其构建方法包括如下步骤：步骤1：在表皮生长因子的核苷酸序列的5’末端加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端加入Sacl限制性酶切位点；步骤2：克隆获得pUC57-EGF克隆载体；步骤3：通过Xbal/Sacl从步骤2所得的克隆载体中获得基因片段EGF，克隆至双元植物载体pCam35S，获得表达载体p35S-EGF。...

【专利技术属性】
技术研发人员：王跃驹，马洁，焦顺昌，
申请(专利权)人：山东益华生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37