本发明专利技术涉及由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的皮肤细胞增殖效果得到增加的热稳定性人表皮细胞生长因子‑蜘蛛毒融合蛋白；编码由大肠杆菌密码子优化的SEQ ID NO：1的碱基序列组成的人表皮细胞生长因子‑蜘蛛毒融合蛋白的基因；包含所述基因的重组载体；由所述重组载体转化的宿主细胞；通过使用所述重组载体转化宿主细胞来生产人表皮细胞生长因子‑蜘蛛毒融合蛋白的方法；以及包含人表皮细胞生长因子‑蜘蛛毒融合蛋白作为有效成分的用于改善皮肤皱纹及维持皮肤弹性的化妆料组合物；本发明专利技术的化妆料组合物具有热稳定性优异，并且能够增强改善皮肤皱纹及维持皮肤弹性的效果，因此，今后能够有效使用于功能性化妆品领域或美容整形领域中。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】皮肤细胞增殖效果得到增加的热稳定性人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白及包含其作为有效成分的用于改善皮肤皱纹及维持弹性的化妆料组合物
本专利技术涉及皮肤细胞增殖效果得到增加的热稳定性人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白及包含其作为有效成分的用于改善皮肤皱纹及维持弹性的化妆料组合物。
技术介绍
皮肤由表皮、真皮、皮下组织组成。皮肤阻止从外部流入的菌的渗透的同时对维持体内水分和维持体温起到重要的作用。表皮起到保护皮肤和调节体温及维持水分的功能，其由参与皮肤弹性及柔软性的细胞外基质(extracellularmatrix)组成。真皮与皮肤老化有直接的关系。人表皮细胞生长因子(Humanepidermalgrowthfactor，hEGF)与存在于细胞表面的表皮细胞生长因子受体结合，从而诱导表皮细胞生长因子受体的二聚反应(dimerization)。二聚体的表皮细胞生长因子受体使存在于受体内的酪氨酸激酶活化，从而诱导细胞内信号传递系统，并且通过这种过程在细胞内促进了糖酵解作用(glycolysis)和蛋白质合成，最终实现细胞的生长。对皮肤再生起到重要作用的表皮细胞生长因子会随着老化的进行而减少，表皮细胞生长因子的减少会诱发皮肤细胞增殖及移动的减少，从而显示出皮肤的老化、皱纹的增加、弹性的减少等现象。作为巴西流浪蜘蛛(Phoneutrianigriventer)的蜘蛛毒中的一种的PnTx2-6由403个核苷酸组成，所述核苷酸由多数的谷氨酸(glutamate)和信号肽(signalpeptide)组成。已知PnTx2-6对钠离子通道(sodiumchannel)的流动产生影响，并且诱导经过麻醉的老鼠的勃起。已知巴西流浪蜘蛛的蜘蛛毒为3,500～9,000Da大小的多肽且有100种以上，其在河豚毒素敏感型通道(TTX(tetrodotoxin)-sensitiveway)中诱导乙酰胆碱(acetylcholine)和谷氨酸的分泌，使向皮质突触体(corticalsynaptosomes)内的钠离子的流入增加，从而干扰钠通道的失活。由此会产生持续勃起症(priapism)现象。诱导持续勃起症现象的巴西流浪蜘蛛的蜘蛛毒中的一种的PnTx2-6是2010年以后在全世界范围内可代替万艾可(Viagra)的天然蛋白质，正在对其进行持续的研究。然而，到目前为止准确的PnTx2-6的细胞内作用机理还不得而知，而且，已知的关于使用为代替万艾可的天然蛋白质的大量生产的研究也很少。另外，韩国授权专利第1613302号公开了“SV82多肽及含有其作为有效成分的用于改善皮肤皱纹及维持弹性的化妆料组合物”，韩国公开专利第2015-0056022号公开了“包含表皮细胞生长因子的融合蛋白的用于改善皮肤的化妆料组合物”，但是没有记载本专利技术的细胞增殖效果得到增加的热稳定性人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白及含有其作为有效成分的用于改善皮肤皱纹及维持弹性的化妆料组合物。
技术实现思路
要解决的技术问题本专利技术是根据如上所述的要求提出的，本专利技术人将人表皮细胞生长因子融合于蜘蛛毒蛋白质中，从而生产了新型的细胞增殖效果得到增加的热稳定性人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白。所述人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白不仅促进皮肤细胞的增殖，而且热稳定性非常优异，并且将其作为有效成分制备多种化妆品(化妆水、精华液、乳液及霜)剂型，然后进行皮肤测试的结果，确认了受试者的皮肤皱纹改善及弹性维持效果，从而完成了本专利技术。技术方案为了解决上述技术问题，本专利技术提供皮肤细胞增殖效果得到增加的热稳定性人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白，其由SEQIDNO：2的氨基酸序列组成。此外，本专利技术提供编码所述融合蛋白的基因。此外，本专利技术提供包含所述基因的重组载体。此外，本专利技术提供由所述重组载体转化的宿主细胞。此外，本专利技术提供在宿主细胞中生产人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的方法，其包括通过使用重组载体转化宿主细胞来过表达编码人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的基因的步骤。此外，本专利技术提供用于改善皮肤皱纹及维持皮肤弹性的化妆料组合物，其包含由SEQIDNO：2的氨基酸序列组成的皮肤细胞增殖效果得到增加的热稳定性人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白作为有效成分。专利技术效果本专利技术的利用大肠杆菌密码子优化的人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的编码基因的在大肠杆菌中的生产方法中，由于蛋白质在大肠杆菌内以包涵体的形态表达，从而简化了生产工序，并且实现了蛋白质的大量生产，通过所述方法生产的人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白具有热稳定性，并且改善皮肤皱纹及维持皮肤弹性的功能优异，因此，能够有效地使用为功能性化妆料原料。附图说明图1为关于制作包含人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白(ESV)编码基因的重组质粒(pET22b::ESV)的过程及转化至大肠杆菌中的模式图。图2为确认在大肠杆菌中人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白(人表皮细胞生长因子融合于蜘蛛毒蛋白质的氨基末端的人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白，ESV)是否表达及分离的结果。A是为了确认是否表达而在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中实施电泳的结果。1：尺寸标记；2～4：诱导(induction)表达前的细胞粗溶解物(crudelysate)；5～7：诱导表达后的细胞粗溶解物；8：诱导表达后的总水溶性蛋白质；9：诱导表达后的总不溶性(包涵体，inclusionbody)蛋白质；箭头：预期的ESV。B为在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中对使用镍琼脂糖柱最终分离的人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白进行电泳的结果；C是为了确认最终分离的人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的人表皮细胞生长因子域而使用EGF检测试剂盒来确认人表皮细胞生长因子域的结果。C为EGF对照组；T为测试样品。图3为用人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白(ESV)处理皮肤成纤维细胞，然后通过结晶紫染色来确认皮肤成纤维细胞的细胞增殖效果的照片。图4为为了鉴定蛋白质的热稳定性而对人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白(ESV)分别进行γ射线灭菌或高压灭菌，然后用其处理皮肤成纤维细胞，并通过结晶紫染色确认基于各蛋白质处理的皮肤成纤维细胞的细胞是否增殖的照片。图5为用人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白(ESV)处理HaCaT细胞，然后确认HaCaT细胞的增殖效果的结果。图6为用人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白(ESV)处理HaCaT细胞，然后观察HaCaT细胞的伤口治愈效果的细胞照片。图7为用HaCaT细胞处理涂布人表皮生长因子-蜘蛛毒融合蛋白(ESV)的多孔，从而确认HaCaT细胞和人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白之间的结合效果的结果。具体实施方式为了实现本专利技术的目的，本专利技术提供皮肤细胞增殖效果得到增加的热稳定性人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白，其由SEQIDNO：2的氨基酸序列组成。本专利技术的人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白的范围包括具有SEQIDNO：2的氨基酸序列的蛋白质及所述蛋白质的功能性等同物。“功能性等同物”是指氨基酸的添加、取代或缺失的结果，与所述SEQIDNO：2的氨基酸序列至少具有70％以上，优选具有80％以上，更优选具有90％以上，最优选具有95％以上的序列同源性，并且显示与由SEQIDNO：2本文档来自技高网...
【技术保护点】
皮肤细胞增殖效果得到增加的热稳定性人表皮细胞生长因子‑蜘蛛毒融合蛋白，其由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.06.03 KR 10-2016-00692721.皮肤细胞增殖效果得到增加的热稳定性人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白，其由SEQIDNO：2的氨基酸序列组成。2.基因，其为编码权利要求1所述的皮肤细胞增殖效果得到增加的热稳定性人表皮细胞生长因子-蜘蛛毒融合蛋白。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因由大肠杆菌密码子优化的SEQIDNO：1的碱基序列组成。4.重组载体，其包含权利要求2或权利要求3所述的基因。5....
【专利技术属性】
技术研发人员：李宣敎，柳汉凤，李星兰，崔钟南，金兑炫，崔泰元，郑泰和，权亨一，
申请(专利权)人：纳丝真生命工学株式会社，李宣敎，
类型：发明
国别省市：韩国,KR
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