一种叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白及其制备方法，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术还公开了一种用于生产表皮生长因子hEGF蛋白的烟草叶绿体表达载体pWYP23404。上述蛋白的制备方法包括以下步骤：构建烟草叶绿体表达载体pWYP23404，EGF基因的烟草叶绿体转化与同质化筛选，得到烟草叶绿体转hEGF基因的同质化植株，叶绿体转基因烟草植株中hEGF表达量分析；表皮生长因子hEGF蛋白的纯化，得到叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白。本发明专利技术在烟草叶绿体中高效表达了hEGF的GFP融合蛋白具备了商业化生产的条件。

Chloroplast expressed epidermal growth factor hEGF protein and preparation method thereof

The invention discloses a chloroplast expressed epidermal growth factor hEGF protein and a preparation method thereof, and the amino acid sequence of the protein is shown as SEQ ID NO.2. The invention also discloses a tobacco chloroplast expression vector pWYP23404 for the production of epidermal growth factor hEGF protein. The preparation methods of the above proteins include the following steps: the construction of the tobacco chloroplast expression vector pWYP23404, the transformation of tobacco chloroplast with EGF gene and homogeneity screening, the homogeneity plant of the tobacco chloroplast transfer hEGF gene, the analysis of hEGF expression in the chloroplast transgenic tobacco plants, and the purification of the epidermal growth factor hEGF protein. The epidermal growth factor hEGF protein expressed in chloroplasts was obtained. The GFP fusion protein with high expression of hEGF in tobacco chloroplast has commercial production conditions.

【技术实现步骤摘要】
一种叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白及其制备方法
本专利技术属于基因工程
，具体地说，涉及一种叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白及其制备方法。
技术介绍
生长因子是细胞合成和分泌的一类活性蛋白质，在动物体内组织中，细胞、生长因子及细胞外基质共处于一个动态环境之中，三者之间的多重相互作用构成了生长因子在体内发挥作用的微环境。通过对造血细胞发育的研究，发现生长因子可通过诱导或调节基因的表达作用于细胞的增殖与分化。随着各种生长因子及其生物学特性被不断揭示，关于生长因子在改善各种生理、病理状态，促进组织再生、创伤修复及愈合过程等方面的研究数据不断积累，在医药等应用领域发挥着越来越重要的作用。同时，生长因子的研究也已成为生物化学、细胞生物学、医学及组织工程学等诸多学科的研究热点问题。表皮生长因子(EGF)是高等动物体内的一种多肽调节因子，由53个氨基酸残基组成，能促进表皮、内皮细胞等多种细胞的生长，提高DNA和蛋白质的合成效率。临床上可用以治疗皮肤创伤、烧伤、角膜损伤及消化性溃疡等。然而人体内生长因子的天然含量极低，每千克组织仅可提取得到微克水平的生长因子，而至今又未找到丰富的组织来源。因此，通过基因工程手段表达上述生长因子具有十分重要的理论研究意义和市场应用前景。叶绿体具有半自主遗传的特点，叶绿体转化是将外源基因通过同源重组的方法整合到叶绿体基因组上并在叶绿体中表达的操作过程。叶绿体转化法排除了植物受体表达差异的影响，并且叶绿体遗传为母系遗传，不受核基因的影响，不会发生像核转化的“基因飘移”造成的生态风险。此外，叶绿体表达消除了基因沉默的影响，且植物中叶绿体基因组的拷贝数很高，理论上每个被转化的叶绿体中，外源基因的拷贝数可以达到1-2万个，因此外源基因的表达量水平可以积累到很高的水平，与传统的微生物发酵体系相比较，生产成本低廉，因而成为理想的生物反应器。此外，叶绿体基因工程生产的大多数蛋白质可完成二硫键交联、正确折叠等转录后修饰，具有正确的空间构象和生物活性，为商业化生产医用蛋白奠定了基础。Staub等(StaubJM,GarciaB,GravesJ,etal.Highyieldproductionofahumantherapeuticproteinintobaccochloroplast[J].NatBiotechnol,2000,18:333-338.)人将生长素基因导入烟草叶绿体基因组中，转基因烟草表达出的人生长素比核转化系统高300倍，且具有正常的生物学活性。2004年，Daniell等(DaniellH,MedicalmolecularPharming,Encyclpediaofplantandcropscience.2004:705-710)将胰岛素生长因子IGF21基因转入烟草叶绿体中，得到成熟的IGF21，表达量占可溶蛋白的32％，重要的是在叶绿体内IGF21可以形成正确的二硫键，而在大肠杆菌内则不能形成。在已有的文献报道中，尽管利用植物叶绿体表达外源基因的表达量大部分好于核转基因植株，但仍有部分事例证明通过该技术获得的转基因植株中外源蛋白表达水平欠佳。绝大多数试验可以通过更换合适的启动子、终止子、5`UTR等调控元件来改善情况，但有报道称EGF基因(Wirth,S.,M.E.Segretin,A.MentaberryandF.B.Almonacid.2006.AccumulationofhEGFandhEGF-fusionproteinsinchloroplast-transformedtobaccoplantsishigherinthedarkthaninthelight.Biochemical&BiophysicalResearchCommunications,125(2):159-172.)在融合GUS基因的条件下，融合蛋白的表达量也只有总可溶性蛋白的0.001％，而没有融合GUS基因的EGF表达，甚至检测不到。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对上述的问题，提供了一种叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白及其制备方法。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还公开了一种编码上述叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还公开了一种用于生产表皮生长因子hEGF蛋白的烟草叶绿体表达载体pWYP23404，该载体以16S-trnI和trnA-23S为左右同源序列，其间插入化学合成的Prrn-T7g10-GFP&EGF-aadA-Trps16表达盒；其中，Prrn启动子和Trps16终止子分别为烟草叶绿体基因组的16SrRNA启动子和rhct1基因mRNA3'端成熟序列(GenBank登录号：NC_001879)；所含的三个基因融合标签基因GFP、目的基因EGF和筛选基因aadA均利用DNA2.0软件进行了密码子优化；在smgfp基因上游和aadA基因下游分别插入同源重组酶识别的attP位点和attB位点。本专利技术还公开了一种上述叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白的制备方法，包括以下步骤：1)构建烟草叶绿体表达载体pWYP23404；2)EGF基因的烟草叶绿体转化与同质化筛选，得到烟草叶绿体转hEGF基因的同质化植株；3)叶绿体转基因烟草植株中hEGF表达量分析；4)表皮生长因子hEGF蛋白的纯化，得到叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白。进一步地，所述步骤1)中的构建烟草叶绿体表达载体pWYP23404具体步骤如下：1.1)、优化表皮生长因子hEGF，得到优化后的表皮生长因子hEGF，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；1.2)、构建烟草叶绿体表达载体pWYP23404：利用化学合成法全基因合成表达框，表达框包含以下两部分：作为融合蛋白标签的绿色荧光蛋白基因的C端添加柔性连接肽链与肠激酶识别位点构成的linker，即氨基酸序列为GSSSGSSSGSSSGSSSDDDDK；而作为筛选标记基因的壮观霉素抗性基因置于带有绿色荧光蛋白基因融合标签的目的基因之后，共同构成由烟草叶绿体启动子Prrn启动、烟草叶绿体终止子Trps16终止的多顺反子表达框，其中，烟草叶绿体启动子Prrn含有核糖体结合位点T7g10序列；1.3)人工合成的表达框在完成目的基因的插入后，利用NsiI进行酶切消化处理后产生的片段与相同酶处理的携带克隆烟草叶绿体基因组中“16Srrn-trnI-trnA-23Srrn的大片段”的克隆载体pEASY-Nt进行连接反应，使人工合成的表达框插入trnI基因和trnA基因之间，最终获得用于生产表皮生长因子的烟草叶绿体表达载体，命名为pWYP23404。进一步地，所述步骤4)中的表皮生长因子hEGF蛋白的纯化筛选具体为：将总可溶性蛋白经0.22μm滤膜抽滤后，置于截流分子量为50KD的超滤离心管中，4000g离心30min，取流出液，再置于截流分子量为30KD的超滤离心管中4000g离心45min后，截留部分液体即为N端融合GFP标签的EGF生长因子的初步纯化产物，利用肠激酶消化，使生长因子与GFP标签蛋白分离开，再用肝素-Seph本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。2.编码权利要求1所述的叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。3.一种用于生产表皮生长因子hEGF蛋白的烟草叶绿体表达载体pWYP23404，其特征在于，该载体以16S-trnI和trnA-23S为左右同源序列，其间插入化学合成的Prrn-T7g10-GFP&EGF-aadA-Trps16表达盒；其中，Prrn启动子和Trps16终止子分别为烟草叶绿体基因组的16SrRNA启动子和rhct1基因mRNA3'端成熟序列(GenBank登录号：NC_001879)；所含的三个基因融合标签基因GFP、目的基因EGF和筛选基因aadA均利用DNA2.0软件进行了密码子优化。4.一种权利要求1所述的叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)构建烟草叶绿体表达载体pWYP23404；2)EGF基因的烟草叶绿体转化与同质化筛选，得到烟草叶绿体转hEGF基因的同质化植株；3)叶绿体转基因烟草植株中hEGF表达量分析；4)表皮生长因子hEGF蛋白的纯化，得到叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白。5.根据权利要求4所述的叶绿体表达的表皮生长因子hEGF蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的构建烟草叶绿体表达载体pWYP23404具体步骤如下：1.1)、优化表皮生长因子hEGF，得到优化后的表皮生长因子hEGF，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；1.2)、构建烟...

【专利技术属性】
技术研发人员：王云鹏，邢少辰，韦正乙，范杰英，
申请(专利权)人：吉林省农业科学院，
类型：发明
国别省市：吉林,22