一种根癌农杆菌介导的胶胞炭疽菌遗传转化方法技术

本发明专利技术公开了一种农杆菌介导的胶胞炭疽菌遗传转化方法，属于生物领域。本发明专利技术通过对根癌农杆菌浓度、胶胞炭疽菌浓度、共培养温度、时间等参数进行优化，成功实现了胶胞炭疽菌的高效遗传转化，该方法不仅具有操作简单，转化率高并且转化稳定等优点，而且为基因工程手段对该菌株进行遗传改良，探究产石杉碱甲关键酶基因，完善产石杉碱甲合成途径，提高产石杉碱甲产量奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种根癌农杆菌介导的胶胞炭疽菌遗传转化方法
本专利技术涉及产石杉碱甲的内生菌胶胞炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)的遗传转化方法。
技术介绍
随着世界范围内人口老龄化进程加剧，老年痴呆的发病率也随之在剧增，它严重制约着老年人的身心健康和生活品质，石杉碱甲是一种强效及高选择性的的可逆性胆碱酯酶抑制剂，主要用于老年痴呆的治疗。目前，石杉碱甲的原料大都来自野生蛇足石杉，然而蛇足石杉的生长速度十分缓慢。曾汉元等尝试通过营养繁殖的方式人工繁育蛇足石杉，压条繁殖在2年可获得的6cm植株。蛇足石杉在培育方面，无论是野生繁育或是通过组织培养，所得植株的生长速度仍旧很缓慢，大面积的农业推广仍然难以进行。而石杉碱甲的化学合成途径，存在工艺复杂、成本昂贵、且疗效不及天然产物，尤其是很难获得纯光学活性的石杉碱甲，目前研究进展仍旧极其缓慢，极大的阻碍了规模化生产及利用。多种植物的体内可获得大量的内生真菌，并且从这些菌体中可以提取分离得到许多有活性的天然化合物。基于此理论，本实验团队经过不懈的努力从湖北恩施的野生石杉属植物体内分离到了近310株内生真菌，经过筛选，发现并获得了一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种根癌农杆菌介导的胶胞炭疽菌遗传转化方法，其特征在于包括以下步骤：1)取含双元载体pTFCM的根癌农杆菌，在含有卡那霉素、链霉素、利福平的LB固体培养基上活化培养，然后挑取活化后的根癌农杆菌单菌落，接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中培养1d，再转入含有卡那霉素的MM液体培养基中培养2d，调整菌液的OD600值为0.3‑0.5，得到根癌农杆菌菌液；2)将活化后的胶胞炭疽菌培养6‑10天，制成浓度为1x105‑1x108个/mL的孢子悬浮液；3)将含有乙酰丁香酮和吗啉乙磺酸的Co‑IM培养基倒平板，并铺一层无菌的玻璃纸，将胶胞炭疽菌孢子悬浮液和根癌农杆菌菌液按0.5‑2：1的体积比混匀后轻...

【技术特征摘要】
1.一种根癌农杆菌介导的胶胞炭疽菌遗传转化方法，其特征在于包括以下步骤：1)取含双元载体pTFCM的根癌农杆菌，在含有卡那霉素、链霉素、利福平的LB固体培养基上活化培养，然后挑取活化后的根癌农杆菌单菌落，接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中培养1d，再转入含有卡那霉素的MM液体培养基中培养2d，调整菌液的OD600值为0.3-0.5，得到根癌农杆菌菌液；2)将活化后的胶胞炭疽菌培养6-10天，制成浓度为1x105-1x108个/mL的孢子悬浮液；3)将含有乙酰丁香酮和吗啉乙磺酸的Co-IM培养基倒平板，并铺一层无菌的玻璃纸，将胶胞炭疽菌孢子悬浮液和根癌农杆菌菌液按0.5-2：1的体积比混匀后轻涂于玻璃纸上，20-30℃共培养12-72h；4)将玻璃纸放于无菌的培养皿内，用含有潮霉素和头孢霉素的PDA培养基培养获得转化子。2.如权利要求1所述根癌农杆菌介导的胶胞炭疽菌遗传转化方法，其特征在于：所述根癌农杆菌菌液...

【专利技术属性】
技术研发人员：舒少华，崔灵利，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42