本发明专利技术公开了一种环状RNA hsa‑circ‑0054020及其特异性扩增引物和应用，其中，所述环状RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其在乳腺癌组织细胞以及患有乳腺癌患者的血液中低表达，可以作为筛查乳腺癌的分子标志物；本发明专利技术还提供一种用于扩增所述环状RNA的特异性扩增引物，所述特异性扩增引物包括上游引物和下游引物，其中，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；本发明专利技术还公开了所述特异性扩增引物在制备用于乳腺癌筛查的试剂盒中的应用及包括所述特异性扩增引物的试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
一种环状RNAhsa-circ-0054020及其特异性扩增引物和应用
本专利技术属于肿瘤分子生物学领域，尤其涉及一种用于乳腺癌诊断的环状RNA，用于所述环状RNA的特异性扩增引物及应用。
技术介绍
乳腺癌是一种常见的女性高危恶性肿瘤，严重影响人们的生活质量。近年来，全世界的女性癌症患者中大约有22.9％为乳腺癌患者，新发现的乳腺癌患者中，中国患者占12.2％。尽管在药物敏感性和外科技术上已有巨大的突破，乳腺癌的复发和转移仍频繁地发生，成为晚期乳腺癌患者死亡的主要原因。早期诊断、早期治疗能够大大减少乳腺癌恶化的进一步发生，随着分子水平的发展以及对乳腺癌发生、发展、治疗相关机制的进一步研究，对靶向诊断和靶向治疗分子标志物的筛选和研究成为乳腺癌研究最受关注的领域之一。环状RNA(CircularRNA，circRNA)是一类不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子，主要由前体RNA(pre-mRNA)通过可变剪切加工产生。circRNA大多数定位于细胞质中，少数定位于细胞核内，大多数由外显子形成。circRNA不易被核酸外切酶降解，与线性RNA相比能更稳定地存在于生物体内，其在不同的物种中具有保守性，同时在不同组织及发育阶段具有表达特异性，大多数circRNA在不同的物种间含量丰富且都具有组织特异性，在人体组织、唾液、血液和外泌体中都有稳定表达，这使得circRNA成为肿瘤患者诊断、治疗和预后追踪的理想生物标志物。近年来，关于circRNA与肿瘤之间的关系研究已有很多报道，已经明确circRNA具有调节肿瘤细胞增殖、凋亡、血管形成、代谢以及耐药等功能。Zhang等通过对不同泌乳时期的两组老鼠的乳腺组织进行circRNA芯片检测，发现circRNA在不同泌乳期老鼠乳腺组织中的表达有很大差异，两个时期检测到circRNA种类大多数不同。因此，circRNA可能是乳腺癌精准诊疗的新靶点，发现和筛选乳腺癌相关的circRNA标志物，对早期防治乳腺癌具有重要的意义和价值。
技术实现思路
本申请的目的在于提供以下几个方面：第一方面，本申请提供一种环状RNA，所述环状RNA的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，其中，起始两个核苷酸与最末两个核苷酸为成环结合位点。所述环状RNA在circ-RNA数据库中的全称为hsa-circ-0054020，简称circ-0054020，定位于人类2号染色体正义链36744469-36774314区域，由CRIM1基因外显子(exon)12、13、14、15、16区剪切环化而成。图1为所述环状RNA的基因结构图，如图1所示，所述环状RNAcirc-0054020的序列全长944bp，其中，CDS为蛋白质编码区。根据本申请的第二方面，提供本专利技术第一方面所述环状RNAcirc-0054020作为筛查乳腺癌的分子标志物的用途。通过生物信息学预测，专利技术人发现环状RNAcirc-0054020的应答原件miR-30e，该基因能够通过ITGB3信号通路影响肿瘤细胞凋亡。并且，本专利技术研究发现相对于乳腺癌患者癌旁正常组织，环状RNAcirc-0054020在乳腺癌组织中显著下调；在血液样本中，相对健康人群，环状RNAcirc-0054020在乳腺癌患者血液中也显著下调。因此，所述环状RNAcirc-0054020可用于乳腺癌筛查。第二方面，本申请还提供所述环状RNA用作筛查乳腺癌的分子标志物的用途。第三方面，本申请还提供一种用于扩增第一方面所述环状RNA的特异性扩增引物，所述特异性扩增引物包括上游引物和下游引物，其中，所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。具体地，所述上游引物的核苷酸序列为：5’-GCCTCAGTTGTGGTTCCCAT-3’；所述下游引物的核苷酸序列为：5’-ACAAAGTCATCTTAGTTGGTGTTCG-3’。在一种可实现的方式中，所述上游引物的GC含量为55.0％，所述下游引物的GC含量为40.0％，其中，所述GC含量是指在DNA4种碱基中，鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比率。进一步地，所述上游引物的TM值为58.1，所述下游引物的TM值54.8，验证后上下游引物qPCR使用时的最适合TM值为60，其中，所述TM值是指上游引物或者下游引物的熔解温度。本专利技术人发现，使用本申请提供的特异性扩增引物对第一方面所述RNA进行扩增，如实施例1所示，将扩增结果进行分析，得到ROC曲线，结果如图4所示，ROC曲线下面积为0.944，这表明使用本申请提供的特异性扩增引物得到的扩增产物为单一条带，无非特异性扩增，所述特异性扩增引物能够作为该种检测的特异性标志物。第四方面，本申请还提供一种扩增第一方面所述环状RNA的方法，所述方法包括：步骤1，合成第一链cDNA：混合原料，所述原料包括第一方面所述环状RNA、随机引物、ddH2O、dNTP混合液、反转录缓冲液、RNA酶抑制剂、反转录酶，按照第一程序控温反应；步骤2，对步骤1制得的第一链cDNA进行实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)扩增：配制扩增体系，所述扩增体系包括步骤1制备的cDNA、第三方面所示的上游引物、第三方面所示的下游引物、ddH2O、qPCR扩增Mix(含SYBGREEN染料)，按照第二程序控温反应。在一种可实现的方式中，步骤1中，所述原料的按照如下配比混合：1μl第一方面所述环状RNA，1μl随机引物，10μlddH2O，2μldNTP混合液，4μl反转录缓冲液，1μlRNA酶抑制剂，1μl反转录酶，其中，所述dNTP混合液包括dATP，dGTP，dCTP和dTTP；所述第一程序为：25℃条件下反应5min，42℃条件下反应60min，70℃条件下反应5min。使用ABIPCR扩增仪进行反转录，所述cDNA置于-80℃储存备用。进一步地，在步骤2中，所述扩增体系按照如下配比配制：2μl步骤1制备的cDNA，0.5μl如第三方面所述的上游引物，0.5μl第三方面所述的下游引物，7μlddH2O，10μlqPCR扩增Mix(SYBGREEN染料)；所述第二程序为：95℃预变性10s，然后以95℃反应15s、60℃反应30s、72℃反应40s进行40个循环，以95℃反应5s、65℃反应1min、37℃反应1min，最后终止反应。第五方面，本申请还提供前述特异性扩增引物在制备用于乳腺癌筛查的试剂盒中的应用。第六方面，本申请还提供一种用于乳腺癌筛查的试剂盒，所述试剂盒包括第三方面所述的特异性扩增引物。在一种可实现的方式中，所述试剂盒还包括反转录酶、缓冲液、ddH2O、DNA聚合酶、荧光染料和dNTP混合液中的至少一种。所述试剂盒可使用qPCR的方法检测乳腺癌组织及外周血中的circ-0054020，用于筛查乳腺癌。本申请人发现，本申请所述的环状RNA在乳腺癌组织细胞中呈现低表达，即，乳腺癌组织中所述环状RNA的含量远低于癌旁组织中该RNA含量，因此，所述环状RNAcirc-0054020可以用作乳腺癌筛查的分子标志物，而且，本申请提供的用于扩增所述环状RNA的特异性扩增引物对所述环状RNA具有高度稳定性、特异性和敏感性，其中灵敏度可达本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种环状RNA，其特征在于，所述环状RNA在circ‑RNA数据库中的全称为hsa‑circ‑0054020，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
1.一种环状RNA，其特征在于，所述环状RNA在circ-RNA数据库中的全称为hsa-circ-0054020，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.权利要求1所述环状RNA用作筛查乳腺癌的分子标志物的用途。3.用于扩增权利要求1所述环状RNA的特异性扩增引物，其特征在于，所述特异性扩增引物包括上游引物和下游引物，其中，所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。4.一种扩增权利要求1所述环状RNA的方法，其特征在于，所述方法包括：步骤1，合成第一链cDNA：混合原料，所述原料包括权利要求1所述环状RNA、随机引物、ddH2O、dNTP混合液、反转录缓冲液、RNA酶抑制剂、反转录酶，按照第一程序控温反应；步骤2，对步骤1制得的第一链cDNA进行实时荧光定量聚合酶链式反应扩增：配制扩增体系，所述扩增体系包括步骤1制备的cDNA、如权利要求3所示的上游引物、如权利要求3所示的下游引物、ddH2O、qPCR扩增荧光染料Mix，按照第二程序控温反应。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1中，所述原料的按照如下配比混合：1μl权利要求1所述环状...
【专利技术属性】
技术研发人员：王立斌，张旭，李晓菡，
申请(专利权)人：宁夏医科大学总医院，
类型：发明
国别省市：宁夏,64
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