一种高特异性ABE碱基编辑系统及其在β血红蛋白病中的应用技术方案

本发明专利技术提供了一种高效靶向HBG1和HBG2启动子区域的ABE碱基编辑系统，可用于治疗β血红蛋白病，所述系统包括多种特异靶向HBG基因启动子区域的高特异性gRNA，将该系统导入到人的体细胞中，催化靶位点处腺嘌呤(Adenine，A)至鸟嘌呤(Guanine，G)的高效置换，提高HBG1和HBG2的表达水平，从而治疗β血红蛋白病(如β‑地中海贫血、镰刀型细胞贫血症等疾病)。该技术在β血红蛋白病基因治疗领域，具有广泛的应用前景。

A Highly Specific ABE Base Editing System and Its Application in Beta Hemoglobin Disease

The present invention provides an efficient ABE base editing system targeting HBG1 and HBG2 promoter regions, which can be used for the treatment of beta hemoglobinopathy. The system includes a variety of highly specific gRNA targeting HBG gene promoter regions. The system is introduced into human somatic cells to catalyze the efficient substitution of adenine (A) to guanine (G) at the target site and improve HBG1 and HBG2. The expression level can be used to treat beta-hemoglobinopathy (such as beta thalassemia, sickle cell anemia, etc.). This technology has broad application prospects in the field of gene therapy of beta hemoglobin disease.

【技术实现步骤摘要】
一种高特异性ABE碱基编辑系统及其在β血红蛋白病中的应用
本专利技术涉及基因修饰领域，更具体地，涉及一种高特异性ABE碱基编辑系统及其在基因编辑、基因治疗、尤其在β血红蛋白病治疗中的应用。
技术介绍
β血红蛋白病是由红细胞血球蛋白合成异常导致的遗传疾病,主要包括β地中海贫血和镰刀型细胞贫血症。成年人的血球蛋白包含HbA2(2.5％)，HbF(0.5％)和HbA1(97％)三种类型。其中占比最大的HbA1蛋白由2个α球蛋白亚基和两个β球蛋白亚基组成。HbF蛋白由2个α球蛋白亚基和两个γ球蛋白亚基组成。由其中β血红蛋白病是由血球蛋白β球蛋白亚基突变导致的一种常见单基因遗传疾病，其编码基因为HBB(humanβglobin)。γ球蛋白亚基由HBG1和HBG2两个基因编码。临床研究发现，HbF高表达可以缓解β地中海贫血和镰刀型细胞贫血症的症状。故而，提高HbF的表达成为治疗β血红蛋白病的治疗方法之一。前人的研究发现，将位于HBG1和HBG2启动子区域内的GTGTGGGGAAGGGGCCCCCAAG序列中的A(下划线标注)突变成G,可以提高γ球蛋白的表达(Wienert,B.etal.KLF1drivestheexpressionoffetalhemoglobininBritishHPFH.Blood130,803-807(2017))。ABE碱基编辑系统是由TadA:TadA*:Cas9融合蛋白和gRNA两部分组分组成的。在gRNA的引导下，TadA:TadA*:Cas9融合蛋白能够与DNA上的靶位点结合，其中与gRNA互补的DNA链会被Cas9核酸酶切断，而非互补链上4-9位的A碱基则会被腺嘌呤脱氨酶——TadA蛋白——催化脱氨基形成I碱基。随着DNA的复制，I(次黄嘌呤，Inosine)碱基会被G(鸟嘌呤,Guanine)碱基替代，从而实现A至G的碱基置换。2017年，哈佛大学的DavidLiu组发现，利用ABE碱基编辑系统结合引导序列为GUGGGGAAGGGGCCCCCAAG的gRNA(命名为HBG-GX19gRNA,SEQIDNO.6)可以将GTGTGGGGAAGGGGCCCCCAAG序列中的A(下划线标注)突变成G。提取患者自身的造血干细胞(Hematopoieticstemcell,HSC)或骨髓细胞，利用腺嘌呤碱基编辑系统编辑HBG1和HBG2的启动子区，则能在原基因座上精确改变HBG1和HBG2的启动子序列，提高HBG1和HBG2的表达，该方法具有效率高、安全性高等特点。将突变修复了的HSC回输给患者，则能治疗β血红蛋白病人。但是，我们的研究发现，DavidLiu组提供的HBG-GX19gRNA(SEQIDNO.6)和ABE碱基编辑系统有脱靶效应。因此，有必要提供一种具有更高特异性的gRNA和ABE碱基编辑系统来编辑HBG1和HBG2的启动子区域，以上调γ球蛋白的表达，提高HbF的水平，从而治疗β血红蛋白病。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述靶向HBG1和HBG2启动子区域的ABE碱基编辑系统有脱靶效应，而提供一种具有更高特异性的gRNA以及更高编辑效率的ABE碱基编辑系统、本专利技术提供的ABE碱基编辑系统通过编辑HBG1和HBG2的启动子区域，以上调γ球蛋白的表达，提高HbF的水平，从而治疗β血红蛋白病。在本专利技术一具体实施例中，本专利技术通过改变gRNA的长度，开发了具有更高特异性的HBG-GGX20(SEQIDNO.1),HBG-GX20(SEQIDNO.2),HBG-GX17(SEQIDNO.3)和HBG-GX16(SEQIDNO.4)，并将其与TadA:TadA*:Cas9融合蛋白ABE碱基编辑系统联用，特异将HBG1和HBG2启动子区域内的GTGTGGGGAAGGGGCCCCCAAG序列中的A(下划线标注)突变成G，从而治疗β血红蛋白病。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：第一方面，本专利技术提供了一种靶向HBG1和HBG2启动子区域的gRNA，所述gRNA序列的核苷酸序列包括SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4中的至少一种。在本专利技术第一方面一具体实施例中，所述gRNA序列还包括骨架序列，其中gRNA的骨架序列为：GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU(SEQIDNO.7)。可以理解的是，本专利技术SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示gRNA序列为gRNA引导序列，本专利技术SEQIDNO.7只是一个具体示例，不限定本专利技术保护范围，本领域技术人员可根据需要采用其他替代骨架序列，应纳入本专利技术保护范围。第二方面，本专利技术提供了一种靶向编辑HBG1和HBG2启动子区域的ABE碱基编辑系统，所述ABE碱基编辑系统包括TadA:TadA*:Cas9融合蛋白，还包括靶向HBG1和HBG2启动子区域的gRNA，所述gRNA序列的核苷酸序列包括SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4中的至少一种。在本专利技术第二方面一具体实施例中，所述TadA:TadA*:Cas9融合蛋白包括CRISPR/Cas系统的效应蛋白结构域、腺苷脱氨酶结构域。在本专利技术第二方面一具体实施例中，所述TadA:TadA*:Cas9融合蛋白包括CRISPR/Cas系统的效应蛋白结构域、连接多肽、腺苷脱氨酶结构域。本领域技术人员可以理解的是，本专利技术所述的TadA:TadA*:Cas9融合蛋白由Cas9效应蛋白与腺苷脱氨酶(简称TadA蛋白)融合而成，本领域技术人员可以根据需要，利用一条或多条连接多肽，将一个Cas9效应蛋白结构域与一个或多个TadA蛋白进行连接，获得融合蛋白，在本专利技术一具体实施例中，所述TadA蛋白均重复一次。可以理解的是，所述Cas9效应蛋白和TadA蛋白的N端和C端的连接顺序为本领域常规技术，连接多肽包括但不限于本领域常规的连接多肽片段，常见地，比如GSlinker。本领域技术人员可以理解的是，TadA:TadA*:Cas9融合蛋白中，TadA为腺苷脱氨酶的缩写，TadA*为TadA突变体的缩写，Cas9为CRISPR/Cas系统的Cas9效应蛋白。进一步地，所述CRISPR/Cas系统的效应蛋白结构域中，所述Cas9效应蛋白包括但不限定于无切割活性或仅具有单链切割活性的Cas蛋白StreptococcuspyogenesCas9(SpCas9),StaphylococcusaureusCas9(SaCas9),LachnospiraceaeCpf1(LbCpf1),AcidaminococcusCpf1(AsCpf1),StreptococcusthermophilusCas9(StCas9),andNeisseriameningitidisCas9(NmCas9)和FrancisellaCpf1(FnCpf1)等。在本专利技术第二方面一具体实施例中，所述TadA:TadA*:Cas9融合蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.5所示氨基酸至少80％、85％、90％、92％、95％、96本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向HBG1和HBG2启动子区域的gRNA，其特征在于，包含gRNA序列，所述gRNA序列的核苷酸序列包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4中的至少一种。

【技术特征摘要】
1.一种靶向HBG1和HBG2启动子区域的gRNA，其特征在于，包含gRNA序列，所述gRNA序列的核苷酸序列包括SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4中的至少一种。2.一种靶向编辑HBG1和HBG2启动子区域的ABE碱基编辑系统，其特征在于，所述ABE碱基编辑系统包括TadA:TadA*:Cas9融合蛋白，还包括靶向HBG1和HBG2启动子区域的gRNA，所述gRNA序列的核苷酸序列包括SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4中的至少一种。3.根据权利要求2所述的ABE碱基编辑系统，其特征在于，所述TadA:TadA*:Cas9融合蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.5所示氨基酸至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％一致的序列。4.一种非天然存在的或工程化的组合物，其特征在于，所述组合物为1)-6)中的一种或多种：1)包含一种或多种载体，该一种或多种载体包含组分I和组分II：所述组分I包括第一调节元件，以及与所述第一调节元件可操作地连接的编码如权利要求2所述的TadA:TadA*:Cas9融合蛋白的编码序列；所述组分II包括第二调节元件，以及与所述第二调节元件可操作地连接的编码如权利要求1所述的gRNA序列；其中，组分I和II位于相同或不同载体上；2)包含如权利要求2所述的TadA:TadA*:Cas9融合蛋白的mRNA以及载体，所述载体包括第二调节元件，以及与所述第二调节元件可操作地连接的编码如权利要求1所述的gRNA序列；3)包含如权利要求2所述的TadA:TadA*:Cas9融合蛋白的蛋白以及载体，所述载体包括第二调节元件，以及与所述第二调节元件可操作地连接的编码如权利要求1所述的gRNA序列；4)包含如权利要求2所述的TadA:TadA*:Cas9融合蛋白的表达载体以及如权利要求1所述的gRNA；5)包含如权利要求2所述的TadA:TadA*:Cas9融合蛋白的mRNA以及如权利要求1所述的gRNA；6)包含如权利要求2所述的TadA:TadA*:Cas9融合蛋白的蛋白以及如权利要求1所述的gRNA。5.一种用于在体细胞或个体内靶向编辑HBG1和HBG2启动子区域的方法，其特征在于，包括：递送如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：松阳洲，梁普平，黄军就，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44