一种魁蚶来源的具有免疫增强活性的β-1,3葡聚糖内切酶及其编码多核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及具有免疫增强活性的葡聚糖内切酶和编码该酶的基因核苷酸序列，属生物技术领域。本发明专利技术提供了葡聚糖水解酶系中关键酶之一的β‑1,3葡聚糖内切酶蛋白质序列及其基因核苷酸序列。该酶来源于魁蚶(Arca inflata Reeve)，包含333个氨基酸，对应的编码基因核苷酸全长为999bp，G+C含量为39.34％，为新的葡聚糖水解酶资源。利用该酶基因核苷酸构建的工程菌株能高效表达β‑1,3葡聚糖内切酶，该酶在以昆布多糖为底物时的Kd值是13.09μM，生产的酶制剂可用于食品，医药，饲料，洗涤等工业，不仅可以解决富含葡聚糖的生物质废料的再利用问题，还可以取得丰富的葡聚寡糖产生可观的经济效益。

【技术实现步骤摘要】
一种魁蚶来源的具有免疫增强活性的β-1,3葡聚糖内切酶及其编码多核苷酸
本专利技术涉及一种魁蚶来源的具有免疫增强活性的葡聚糖水解酶β-1,3葡聚糖内切酶及其编码基因核苷酸，属于生物
，生产的酶制剂用于食品，医药，饲料，洗涤等工业，不仅可以解决富含葡聚糖的生物质废料的再利用问题，还可以取得丰富的葡聚寡糖产生可观的经济效益。
技术介绍
葡聚糖是植物和微生物细胞壁的主要成分，占植物总干重的30％～50％，是地球上分布最广、含量最丰富的可再生碳源化合物，占地球总生物量的40％。据报道，我国每年光作物秸杆、稻梗、海带等含葡聚糖较丰富的生物质就有5亿吨之多，全球每年通过光合作用产生的植物生物质高达1.55×109吨，其中尚有89％未被人们利用，而大量的秸杆、稻梗等含葡聚糖丰富的生物质利用率很低，大多采用燃烧的方法来处理，这样就造成了环境污染，破坏了土壤的理化性质和丧失了有机质成分。所以，葡聚糖生物质的充分利用与有效的转化对于解决当前的能源危机、粮食短缺、环境污染等有重大的意义。葡聚糖酶是分解葡聚糖的一类酶，它能将葡聚糖分解为单分子葡萄糖或低分子量寡糖，充分的利用了葡聚糖生物资源。自1906年Sellieres在蜗牛消化液中发现β-1,4葡聚糖酶以来，葡聚糖内切酶的研究和应用受到了国内外学者的极大关注，取得了很大进展。目前，国内外学者通过筛选产酶菌株和分离纯化寻找葡聚糖酶，再应用到食品、医药、饲料、纺织、洗涤和能源等工业中，不仅解决了葡聚糖的再利用问题还取得了很可观的经济效益。葡聚糖酶是多酶组分的一个复杂酶系，主要来自于软体动物、植物、真菌和细菌。根据酶功能的不同，分为三大类：葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶。采用基因工程手段构建高效表达菌株可以实现葡聚糖酶的大量表达，目前有近100多个葡聚糖酶基因可在大肠杆菌中克隆和表达，主要是葡聚糖内切酶和β-葡萄糖苷酶。葡聚糖内切酶基因的获得在葡聚糖生物质高效利用领域有巨大的应用潜力，同时可通过对葡聚糖内切酶的生物活性进行探索，以期更好得开发利用葡聚内切糖酶资源，实现生物量的转化利用和酶制剂多功能化，这对人类的可持续发展具有非常重要的意义。魁蚶(ArcainflataReeve)属于动物门，瓣鳃纲，蚶目，蚶科，是我国资源丰富的海产生物之一。魁蚶个大体肥，肉质鲜美，古书中记载魁蚶有“令人能食、益血色、消血块和化痰积”之功效，营养价值和经济价值很高，是我国及亚洲沿海地区重要的经济贝类之一。通过查阅相关文献资料发现，国外学者从魁蚶中表征和表达了一种具有抗菌活性和免疫调节活性的多肽，而魁蚶葡聚内切糖酶的研究未见报道。故魁蚶葡聚糖内切酶将高价值利用魁蚶这一海洋生物资源，扩大葡聚糖内切酶资源的同时具有重大经济意义，为合理、高效利用海洋资源提供理论依据。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是提供一种具有免疫增强活性的β-1,3葡聚糖内切酶及其编码基因核苷酸，属于生物
，生产的酶制剂用于食品，医药，饲料，洗涤等工业，不仅可以解决富含葡聚糖的生物质废料的再利用问题，还可以取得丰富的葡聚寡糖产生可观的经济效益。技术方案本专利技术提供的魁蚶(ArcainflataReeve)β-1,3葡聚糖内切酶，分子量51.03kDa，其氨基酸序列为SEQIDNO.1。本专利技术涉及的魁蚶(ArcainflataReeve)β-1,3葡聚糖内切酶是按照如下方法制备的：将新鲜魁蚶(ArcainflataReeve)剥壳、取出内容物清洗，加入磷酸盐缓冲液匀浆提取，离心，取上清液，硫酸铵分级沉淀，取70-100％盐析沉淀复溶透析脱盐，采用离子交换柱层析分离，收集酶活性峰，透析脱盐后经疏水层析柱分离，收集酶活性峰，透析脱盐后经空间排阻凝胶柱分离，得到魁蚶(ArcainflataReeve)中β-1,3葡聚糖内切酶。本专利技术还公开了从魁蚶(ArcainflataReeve)中分离的β-1,3葡聚糖内切酶的编码基因，该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为999bp，G+C含量为43.77％，其核苷酸序列为：SEQIDNO.2。本专利技术还公开了含有所述魁蚶(ArcainflataReeve)β-1,3葡聚糖内切酶的编码基因的重组表达质粒和含有重组质粒的重组微生物E.coliBL21(DE3)。本专利技术涉及的魁蚶(ArcainflataReeve)β-1,3葡聚糖内切酶的重组表达质粒和含有重组质粒的重组微生物E.coliBL21(DE3)是按照如下方法制备的：用分别含NdeI和HindIII的正反向PCR引物从阳性克隆子中扩增出魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶基因片段；经NdeI和HindIII双酶切后和同样用这两种酶切好的pET-28a(+)进行酶连，酶连好的含魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶基因的pET-28a(+)重组质粒转化到表达宿主菌E.coliBL21(DE3)获得重组微生物E.coliBL21(DE3)，转接到含有50mg/L卡那霉素的平板，37℃培养16h后挑取阳性转化子，经测序验证基因序列无误后，保存。上述魁蚶(ArcainflataReeve)β-1，3葡聚糖内切酶及其编码基因可以在食品，医药，饲料，洗涤等工业中得到应用。有益效果1.以海洋经济贝类魁蚶为材料，运用现代生化分离技术，如磷酸盐缓冲液提取，硫酸铵沉淀，离子交换层析、疏水层析和空间排阻层析，分离纯化出β-1,3葡聚糖内切酶(葡聚糖降解过程中的关键酶之一)及其编码基因。2.该酶包含333个氨基酸，编码基因全长为999bp，G+C含量为39.34％。3.通过PCR技术扩增末端含NdeI和HindIII酶切位点的完整的β-1,3葡聚糖内切酶基因片段，将它连接到大肠杆菌高表达载体pET-28a(+)(购自Novegen公司)的NdeI和HindIII酶切位点上，转化表达宿主菌E.coliBL21(DE3)(购自Invitrogen公司)，进行IPTG诱导表达。4.本专利技术对分离的魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶及其编码基因表达的产物，做了酶活性测定，能高效的水解昆布多糖(laminarin)，比活力为90.01U/mg，在以昆布多糖(laminarin)为底物时的Kd值为13.09μM，薄层层析色谱(TLC)能够将昆布多糖水解为葡聚寡糖分子。5.魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶的最适pH和pH稳定性的测试结果表明，本专利技术魁蚶β-1，3葡聚糖内切酶的最适pH为6.0，在pH5.5-7.5范围内均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在80％以上。魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶的最适温度和热稳定性的测试结果表明，魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶的最适温度为40℃，在45℃下温育60min，酶活力仍保留60％以上。不同金属离子化学试剂对魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶的影响测试结果表明，大部分金属离子和化学试剂对魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶的活力没有明显影响，Mn2+和Mg2+在2mM时对魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶的活力有促进作用，Cu2+、Zn2+和Ba2+在2mM时对魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶的活力有明显抑制作用。6.魁蚶β-1,3葡聚糖内切酶除可作用于昆布多糖外，对于茯苓多糖(pachyman)和大麦葡聚糖(barleyglucan)也有一定的降解作用。其对茯苓多糖的降解能本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.具有免疫增强活性的魁蚶(Arca inflata Reeve)β‑1,3葡聚糖内切酶，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.1。

【技术特征摘要】
1.具有免疫增强活性的魁蚶(ArcainflataReeve)β-1,3葡聚糖内切酶，其氨基酸序列为：SEQIDNO.1。2.权利要求1所述的免疫增强活性的β-1,3葡聚糖内切酶的分离制备方法，其特征在于包括如下步骤：将新鲜魁蚶(ArcainflataReeve)剥壳、取出内容物清洗，加入磷酸盐缓冲液匀浆提取，离心，取上清液，硫酸铵分级沉淀，取70-100％盐析沉淀复溶透析脱盐，采用离子交换柱层析分离，收集酶活性峰，透析脱盐后经疏水层析柱分离，收集酶活性峰，透析脱盐后经空间排阻凝胶柱分离，得到魁蚶(ArcainflataReeve)中β-1,3葡聚糖内切酶。3.同权利要求1所述的魁蚶(ArcainflataReeve)β-1,3葡聚糖内切酶蛋白质氨基酸序列同源性大于40％的氨基酸序列。4.权利要求1所述的β-1,3葡聚糖内切酶基因核苷酸序列，序列为：SEQIDNO.2。5.权利要求3所述的β-1,3葡聚糖内切酶核苷酸序列的互补序列。6.同权利要求3所述的魁蚶(ArcainflataReeve)β-1,3葡聚糖内切酶基因核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：于荣敏，李春磊，朱建华，
申请(专利权)人：于荣敏，
类型：发明
国别省市：广东,44