自体胸水上清培养TIL细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用自体胸水上清进行ＴＩＬ细胞的培养方法。本发明专利技术采用将收集的癌性胸水离心后保存上清，用作培养基，将下层细胞中的白膜层细胞至该上清培养基中培养，得悬浮的ＴＩＬ细胞，再至孵箱内培养，１天后加入ＯＫＴ３、ＩＬ－２、ＰＨＡ等，１、２天再加入ＩＬ－２进行培养。本发明专利技术的实验数据表明该方法是可行的，与现有方法相比，某些方面相同，某些方面更优。而本发明专利技术却避免了现有方法使用人ＡＢ血清可能导致的乙肝、爱滋病等传染，体外培养时间过长所增加的污染机率，以及培养时间过长增加病人负担，延长治疗时间和成本增加等缺陷。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种TIL细胞的培养方法，特别涉及一种利用自体胸水上清培养TIL细胞的方法。
技术介绍
肿瘤浸润的淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，简称TIL)是继LAK细胞之后第二代抗肿瘤效应细胞，能够特异性杀伤肿瘤细胞，抗肿瘤活性较LAK细胞强50～100倍，成为临床上主要应用抗肿瘤细胞免疫治疗的手段选择之一。在本专利技术作出之前，制备TIL的方法主要是经非连续密度梯度离心法分离获得TIL，然后在体外用人工合成的培养基，通常是含有10％人AB型血清的RPMI1640培养基培养2周左右时间，再回输病人胸腔，杀伤病人体内的肿瘤细胞。这种TIL培养方法存在着诸多缺陷。一是体外培养时间过长，增加了污染机率，导致不能回输；二是有血清培养基应用人AB型血清，具有潜在的导致乙肝、爱滋病等传染病的可能；三是培养时间长、使用人AB型血清导致成本增加，增加了病人的财务负担，也延长了病人的治疗时间。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于克服上述缺陷，研究、开发了一种利用病人自己胸水上清培养TIL细胞的方法。本专利技术的技术方案自体胸水上清培养TIL细胞的方法，无菌收集癌性胸水，离心后保存上清，用淋巴细胞分离液分离下层细胞，去除下层细胞中的红细胞、坏死组织碎片，其主要技术特征在于(1)将上清留作培养基；(2)取下层细胞中的白膜层细胞至上清培养基培养；(3)12～24小时后，肿瘤细胞全部贴壁，悬浮的是TIL细胞；(4)将浓度在5×105/ml～1×106/ml的TIL细胞置于饱和湿度、5％二氧化碳孵箱内培养，温度控制在37℃内；(5)1天后，加入终浓度50～100ng/ml的OKT3、800～6000U/ml的IL-2、50～100ug/ml的PHA；(6)隔1～2天，加入含800～6000U/ml的IL-2的完全培养基进行培养。本专利技术的优点和效果在于体外培养时间约在2～3天内完成，大大节约了时间，减轻病人的痛苦，降低病人的经济负担；当其活化后即可回输体内进一步培养，避免了自身资源的浪费，减少了体外培养时污染的机率，也避免了有血清培养基所可能导致的各种传染病的传染发生；其方法本身过程简单、易于操作，花费少，效果好。具体实施例方式无菌收集患者的癌性胸水各约1000ml，立即在百级实验室进行TIL与肿瘤细胞的分离，胸水离心后，保存上清留作培养基；下层细胞应用淋巴细胞分离液进行分离，取白膜层细胞用留作培养基的自体上清培养，12～24小时，一般取16小时，可见肿瘤细胞全部贴壁，悬浮细胞几乎都是TIL；将得到的TIL按1×106/ml的浓度悬于自体上清中，置于37℃、5％CO2孵箱内；在24小时内，即一天后加入终浓度为100ng/ml的OKT3、6000U/ml的IL-2、100ug/ml的PHA；隔1～2天，加入含6000U/ml的IL-2的完全培养基进行培养。然后，将培养所获得的TIL在3天即回输患者胸腔，治疗恶性胸水。将TIL应用自体胸水上清培养与TIL用含10％人AB型血清的RPMI 1640培养进行对比。在培养的第3、7、14、21天，经t检验比较对TIL扩增速率的影响发现，二者间无统计意义上的差别，P＞0.05；自体上清培养的TIL各亚型与用含10％人AB型血清的RPMI 1640培养的TIL各亚型所占比例间无统计意义上的差别，P＞0.05；培养一周后，用MTT法检测发现两种培养液培养的TIL对自体肿瘤细胞的杀伤活性与培养前及培养第3天的杀伤活性比较，差异显著，自体上清组尤为显著；培养一周后，其杀瘤活性明显提高，P＜0.05，以自体上清组最为明显；两种培养方法培养的TIL在第3天及第7天的杀瘤活性比较无统计学差异，P＞0.05。应用自体上清作为培养基培养TIL，结果证明，对TIL的生长速度、免疫表型变化及对自体肿瘤细胞的杀伤活性与含有10％人AB型血清的RPMI 1640培养基间无差异，因此自体上清作为培养基培养TIL是可行的；TIL分离后，短期培养3天，当其开始出现增殖、抑制状态可能刚被解除时回输体内，继续依赖自体胸水存活并进一步扩增，发挥杀瘤效应。权利要求1.自体胸水上清培养TIL细胞的方法，无菌收集癌性胸水，离心后保存上清，用淋巴细胞分离液分离下层细胞，去除下层细胞中的红细胞、坏死组织碎片，其特征在于(1)将上清留作培养基；(2)取下层细胞中的白膜层细胞至上清培养基培养；(3)12～24小时后，肿瘤细胞全部贴壁，悬浮的是TIL细胞；(4)将浓度在5×105/ml～1×106/ml的TIL细胞置于饱和湿度、5％二氧化碳孵箱内培养，温度控制在37℃内；(5)1天后，加入终浓度50～100ng/ml的OKT3、800～6000U/ml的IL-2、50～100ug/ml的PHA；(6)隔1～2天，加入含800～6000U/ml的IL-2的完全培养基进行培养。全文摘要本专利技术涉及一种利用自体胸水上清进行TIL细胞的培养方法。本专利技术采用将收集的癌性胸水离心后保存上清，用作培养基，将下层细胞中的白膜层细胞至该上清培养基中培养，得悬浮的TIL细胞，再至孵箱内培养，1天后加入OKT3、IL－2、PHA等，1、2天再加入IL－2进行培养。本专利技术的实验数据表明该方法是可行的，与现有方法相比，某些方面相同，某些方面更优。而本专利技术却避免了现有方法使用人AB血清可能导致的乙肝、爱滋病等传染，体外培养时间过长所增加的污染机率，以及培养时间过长增加病人负担，延长治疗时间和成本增加等缺陷。文档编号C12N5/08GK1560234SQ20041001409公开日2005年1月5日 申请日期2004年2月18日 优先权日2004年2月18日专利技术者刘宝瑞, 邹征云 申请人:南京大学医学院附属鼓楼医院本文档来自技高网...

【技术保护点】
自体胸水上清培养ＴＩＬ细胞的方法，无菌收集癌性胸水，离心后保存上清，用淋巴细胞分离液分离下层细胞，去除下层细胞中的红细胞、坏死组织碎片，其特征在于（１）将上清留作培养基；（２）取下层细胞中的白膜层细胞至上清培养基培养；（３）１２～２４小时后，肿瘤细胞全部贴壁，悬浮的是ＴＩＬ细胞；（４）将浓度在５×１０↑［５］／ｍｌ～１×１０↑［６］／ｍｌ的ＴＩＬ细胞置于饱和湿度、５％二氧化碳孵箱内培养，温度控制在３７℃内；（５）１天后，加入终浓度５０～１００ｎｇ／ｍｌ的ＯＫＴ３、８００～６０００Ｕ／ｍｌ的ＩＬ－２、５０～１００ｕｇ／ｍｌ的ＰＨＡ；（６）隔１～２天，加入含８００～６０００Ｕ／ｍｌ的ＩＬ－２的完全培养基进行培养。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宝瑞，邹征云，
申请(专利权)人：南京大学医学院附属鼓楼医院，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]