本发明专利技术涉及生物医学领域，具体地说是涉及一种体外诱导干细胞向肝细胞定向分化的方法及其用途。本发明专利技术将基因工程与干细胞工程相结合，利用干细胞多向分化的潜能，以稳定表达人肝细胞生长因子的肝基质细胞作为饲养层细胞，诱导干细胞向肝细胞定向分化，并对诱导前后的干细胞进行比较鉴定。该体外诱导体系的建立不仅为“成体干细胞可塑性”的理论提供佐证，而且可作为种子细胞用于肝细胞移植、生物人工肝及微囊化肝细胞制剂等的制备，同时诱导分化的肝细胞可作为体外的药代动力学模型用于细胞药物筛选。此方法的建立将在以基因工程、细胞工程乃至组织工程等为基础的再生医学中具有极佳的应用前景，并将产生巨大的社会效益和经济效益。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学领域，具体地说是涉及一种体外诱导干细胞向肝细胞定向分化的方法及其用途。
技术介绍
对于各种原因(包括病毒感染、毒物、药物中毒、肿瘤、遗传代谢性疾病、肝癌术后等)引发的终末期肝衰竭，原位肝移植是目前唯一有效的治疗手段。然而，由于供肝的极度短缺、手术及移植本身相关的较高死亡率、终生服用免疫抑制剂及其所带来的严重甚至致命的并发症使得肝移植在临床的广泛应用受到极大限制。随着干细胞生物学研究的不断深入，以干细胞为种子细胞的细胞治疗、以干细胞为转运载体的基因治疗将为终末期肝衰竭患者带来新的希望。干细胞是人体及各种组织细胞的最初来源，具有高度自我更新和多向分化潜能及可植入性、重建能力等特征。即这些细胞可以通过细胞分裂维持自身细胞群的大小，又可以进一步分化成为各种组织细胞，构成机体各种复杂的组织器官。干细胞分为全能干细胞(如胚胎干细胞，可以分化为机体所有组织细胞)、多能干细胞(具有多向分化潜能，可以分化为多种组织细胞，如间充质干细胞等)和专能干细胞(维持某一特定组织细胞的单一方向自我更新，如肠上皮干细胞等)。干细胞技术的不断突破及干细胞本身所具有的特性使人类有可能在体外培养某些干细胞，定向诱导其分化为我们所需要的各种组织细胞，或作为种子细胞用于组织工程以供临床所需，以此为目的的干细胞工程涉及人体几乎所有重要组织器官及人类面临的大多数医学难题，如心血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤、骨及软骨缺损、老年性痴呆、帕金森病、烧伤、脊髓损伤和遗传性缺陷等的治疗。由于人脐带血、外周血和骨髓中的多能干细胞，具有增殖能力强、来源丰富、采集方便等优点，此类干细胞移植在血液系统疾病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病等的治疗中发挥了重要的作用。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)是在体内广泛分布的可使多种组织再生的实效分子。HGF对肝细胞增殖、分化、成熟的支持作用是通过特异性地与细胞膜表面受体c-Met结合而发挥作用的。HGF作为具有重要生物学功能的细胞因子已被广泛应用于临床疾病(如急性肝损伤、进行性肝纤维化等)的治疗，其来源主要是从人血浆和胎盘中提取纯化，该方法制备HGF费时、费力、活性差且成本昂贵。而利用基因工程表达人HGF是大量获取具有生物学活性HGF的有效途径之一。我们已经建立了能稳定、高效表达HGF的重组逆转录病毒载体MSCV-HGF，期望能够使HGF得到更广泛的、科学的应用。肝枯否氏细胞、肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)均为肝脏基质细胞，可以通过产生可溶性细胞因子、胶原、胶原酶等创造一个对肝实质细胞的再生、增殖起到重要支持作用的微环境。有研究表明，将肝实质细胞与基质细胞按照一定的比例混合培养会增强其生物学活性，延长其体外生长的寿命。β2M是哺乳动物体内广泛表达于有核细胞表面、最具保守性的蛋白，而在一些具有永生性生长特性的肿瘤细胞及囊胚期的胚胎干细胞表面则不表达该蛋白，因此，β2M-细胞亚群被认为是具有很强的增殖能力的细胞；c-Met是HGF的受体，HGF和c-Met之间相互作用介导一系列信号转导在哺乳动物的肝脏形成和发育阶段发挥重要的作用，因此我们认为，在骨髓中c-Met+细胞是一群具有向成熟肝细胞分化潜能的细胞。综上所述，c-Met+β2M-细胞是一群存在于骨髓或脐带血中的肝干/祖细胞。目前，国内外对于肝干细胞的研究仅证实了它的存在及可能的组成，发现了它的强大再生和转化能力，但将其真正应用于临床尚有待时日，因此，分离不同组织来源的成体干细胞，将其在体外诱导分化为肝细胞作为种子细胞用于肝细胞移植、生物人工肝及微囊化肝细胞制剂等的制备，同时诱导分化的肝细胞可作为体外的药代动力学模型用于细胞药物的筛选。此方法的建立将在以基因工程、细胞工程乃至组织工程等为基础的再生医学中具有极佳的应用前景，并将产生巨大的社会效益和经济效益。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是建立一种体外诱导干细胞分化为肝细胞的方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是 利用干细胞具有多向分化的潜能，体外诱导干细胞向成熟的、有功能的肝细胞定向分化，定向诱导分化后的肝细胞，为肝细胞移植、生物人工肝及微囊化肝细胞制剂等的制备提供种子细胞，同时诱导分化的肝细胞作为体外的药代动力学模型可用于细胞药物筛选。本专利技术中运用的体外诱导方法，是利用稳定表达人肝细胞生长因子的饲养层细胞，支持干细胞向成熟的、有功能的肝细胞定向分化。本专利技术中运用的饲养层细胞是以重组逆转录病毒MSCV-HGF感染肝基质细胞系，建立的稳定表达人肝细胞生长因子的饲养层细胞。本专利技术中运用的肝基质细胞系包括肝枯否氏细胞、肝星状细胞。本专利技术中的干细胞包括人和哺乳动物胚胎、骨髓、动员的外周血、脐带血以及其它组织来源的单个核细胞、c-Met+β2M-细胞、CD34+细胞及Thy-1+细胞。本专利技术中的c-Met+β2M-细胞是用间接免疫磁珠分选方法分离、富集和纯化的人脐带血来源的干细胞。本专利技术利用稳定、高效表达人肝细胞生长因子的肝星状细胞株作为饲养层细胞，可支持人脐带血来源的c-Met+β2M-细胞向成熟的、有功能的肝细胞定向分化。本专利技术建立了不同来源干细胞向肝细胞诱导分化前后的比较鉴定方法。本专利技术中体外诱导干细胞向肝细胞定向分化后肝细胞可作为种子细胞用于肝细胞移植、生物人工肝及微囊化肝细胞制剂等的制备。本专利技术中诱导分化后的肝细胞还可作为体外的药代动力学模型用于细胞药物筛选。具体实施方案如下1.分离不同组织来源的成体干细胞，制备方法是(1)脐带血单个核细胞的分离无菌及ACD抗凝液抗凝条件下经脐静脉穿刺取血，采集健康足月顺产新生儿脐带血，依次经过0.5％甲基纤维素(美国，Sigma公司产品)沉降及Ficoll(美国，Sigma公司产品，相对密度1.077g/ml)密度梯度离心后收集人脐带血单个核细胞，洗涤后重悬于PBS中。(2)骨髓单个核细胞的分离无菌条件下，经双侧髂后上棘穿刺，采集骨髓，依次经0.5％甲基纤维素(美国，Sigma公司产品)沉降及Ficoll(美国，Sigma公司产品，相对密度1.077g/ml)密度梯度离心后收集人骨髓单个核细胞，洗涤后重悬于PBS中。(3)脐带血c-Met+β2M-细胞的分离取重悬于PBS中的人脐带血单个核细胞，先后与兔抗人β2M抗体(美国，Santa Cruz公司产品)及免疫磁珠标记的山羊抗兔IgG(德国，Miltenyi公司产品)孵育后，经MACS高梯度磁场(德国，Miltenyi公司产品)分离纯化，得到β2M-细胞群；再将该群细胞先后与兔抗人c-Met抗体(美国，Santa Cruz公司产品)及免疫磁珠标记的山羊抗兔IgG(德国，Miltenyi公司产品)孵育后，经MACS高梯度磁场分离纯化，最终得到c-Met+β2M-细胞。2.建立高效、稳定表达HGF的肝基质细胞株，制备方法包括以下步骤肝基质细胞常规培养于含10％胎牛血清的DMEM培养液(完全培养液)中，长至40％汇合后，以经0.45μm尼龙滤膜过滤收集的重组逆转录病毒pMSCV-HGF毒液(含8μg/ml的polybrene)感染细胞，反复感染3次(每次间隔24h)后，更换新鲜含700μg/ml G418的培养基进行筛选，每3本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种体外诱导干细胞向肝细胞定向分化的方法，其特征在于利用干细胞具有多向分化的潜能，诱导其向成熟的、有功能的肝细胞定向分化，为肝细胞移植、生物人工肝及微囊化肝细胞制剂等的制备提供种子细胞，同时诱导分化的肝细胞作为体外的药代动力学模型可用于细胞药物筛选。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：裴雪涛，王韫芳，南雪，岳文，白慈贤，闫舫，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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